疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因在毕赤酵母工程菌中的遗传稳定性

【背景】重组工程菌的传代稳定性是保证外源蛋白高效稳定表达的前提,是决定工业化生产能力的关键因素之一。【目的】对异源的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因在毕赤酵母重组工程菌中的遗传稳定性进行研究。【方法】将工程菌连续传代15次,取第1、5、10、15代作为受检代次,结合重组菌的菌落及菌体形态、水解酶活、目的基因片段、外源基因拷贝数等指标综合评价其遗传稳定性。【结果】传代过程中重组菌的菌落和菌体形态、目的蛋白分子量、目的基因序列均保持一致。目的基因的整合拷贝数经5次传代后发生一定损失,但随后稳定为7左右,而脂肪酶的相对酶活则提高至90%以上。【结论】适量的整合拷贝数更有利于该脂肪酶基因在毕赤酵母重组菌中的表达,经综合评价此工程菌的遗传稳定性良好,应用于工业化大规模生产是可行的。     

嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因(Im)的克隆及其在毕赤酵母中的表达

研究从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum中克隆了一个新的脂肪酶基因(lm).其中DNA序列包含一个由870个碱基构成的开放阅读框,编码289个氨基酸,含有4个内含子,没有信号肽序列.序列提交GenBank,登录号为GU338248.将该基因在毕赤酵母中表达.在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,蛋白达到0.428mg/mL,酶活力为19.77U/mg.SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为35kDa.该脂肪酶的最适反应温度为60℃,具有热稳定性,在40-80℃热稳定,80℃处理60min仍有65％的相对酶活.该酶最适反应pH值为10.0,在pH 9.0--12.0酶活相对稳定.该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,具有良好的工业应用价值.     

嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因(lm)的克隆及其在毕赤酵母中的表达(英文)

研究从嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum中克隆了一个新的脂肪酶基因(lm)。其中DNA序列包含一个由870个碱基构成的开放阅读框,编码289个氨基酸,含有4个内含子,没有信号肽序列。序列提交Gen Bank,登录号为GU338248。将该基因在毕赤酵母中表达。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,蛋白达到0.428mg/m L,菌物学报酶活力为19.77U/mg。SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为35k Da。该脂肪酶的最适反应温度为60℃,具有热稳定性,在40–80℃热稳定,80℃处理60min仍有65%的相对酶活。该酶最适反应p H值为10.0,在p H 9.0–12.0酶活相对稳定。该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,具有良好的工业应用价值。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的表面展示及酶学性质

【目的】构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)在毕赤酵母GS115中的细胞表面展示体系,筛选展示成功且酶活力及展示率较高的重组子作为全细胞催化剂,并研究其酶学性质。【方法】克隆TLL基因tll,以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白,构建表面展示载体pPICZαA-TLS。重组载体经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母GS115中,经三丁酸甘油酯平板检测及摇甁发酵筛选获得高酶活力的毕赤酵母重组子,采用抗FLAG标签一抗和R-PE荧光素标记的二抗处理细胞后,进行荧光显微镜检测和流式细胞仪分析,并考察全细胞催化剂的最适反应温度和pH、金属离子耐受性等酶学性质。【结果】成功构建TLL毕赤酵母细胞表面展示体系,筛选到1株具有三丁酸甘油酯和橄榄油水解活力的克隆子,经1%的甲醇诱导发酵120 h后,水解橄榄油酶活力达257.8 U/g干细胞。经抗体处理后的重组菌发酵细胞在荧光显微镜下呈现强烈的红色荧光,流式细胞仪分析结果也证实脂肪酶被成功展示在酵母细胞表面,展示率达98.36%。展示的TLL作为全细胞催化剂水解对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的最适温度为30℃,最适pH为8.0,且具备良好的热稳定性和有机溶剂耐受性;K+、Ca2+、Mg2+对其有微弱的激活作用,Mn2+、Ni2+则有微弱的抑制作用,Cu2+的抑制作用较强,而EDTA、SDS、Tween 20对酶活力影响不明显。【结论】首次将TLL脂肪酶成功展示在毕赤酵母细胞表面,获得具有较高水解活力和良好酶学特性的全细胞催化剂,为表面展示TLL脂肪酶的规模化应用奠定了技术基础。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:实现疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus Lipase,TLL)在大肠杆菌中的可溶性表达,并建立有效的纯化方法。方法:根据疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,合成了疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶DNA序列,克隆至大肠杆菌表达载体PET-32a(+)中,通过筛选得到阳性重组载体,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导表达并利用SDS-PAGE电泳检测重组脂肪酶表达情况,并通过Ni柱亲和层析对目的蛋白TLL进行纯化,透析脱盐后,TEV酶切重组融合蛋白,再利用亲和层析纯化得到酶切后的脂肪酶,检测其酶活。结果:得到了可溶性表达的TLL,检测酶切前后脂肪酶的比活性:酶切前达5.7×106U/mg,酶切后达8.9×105U/mg。结论:实现了疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的可溶性表达,并得到有效纯化,同时证明TEV酶切目的蛋白对其活性影响微小,为之后对其进行环化打下基础。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

HrpN基因在毕赤酵母中的克隆表达与活性检测

将hrpN基因插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA的醇氧化酶（AOX1）启动子下游,构建重组表达载体pPIC6aA-hrpN,经电击转化毕赤酵母菌株X-33和杀稻瘟素筛选,得到高效分泌表达harpin Ea的毕赤酵母菌株。经初步纯化、SDS-PAGE分析和生物测定,结果显示,诱导96h的此重组菌大量表达harpinEa表达产物具有诱导烟草超敏感反应的功能,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinEa。     

PTD-NPY融合基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

应用重叠延伸PCR方法扩增HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)与鼠源神经肽Y(NPY)的融合基因,克隆目的片段并插入酵母表达载体pPICZαA,构建成重组表达质粒pPICZα-PTD-NPY.PCR和酶切鉴定及测序正确后,经限制性内切酶Sac Ⅰ线性化重组表达质粒并通过电转化整合到巴斯德毕赤酵母菌GS115的染色体基因组中.阳性重组酵母菌用含1%甲醇的培养基诱导其分泌表达.经过120 h的诱导,取上清浓缩除盐后进行SDS-PAGE电泳,表明该系统成功表达了PTD-NPY融合蛋白,Western blotting实验证实表达产物具有特异性.获得真核表达的PTD-NPY融合蛋白,为下一步的应用研究提供了物质基础.     

狐狸生长激素基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

为制备重组狐狸生长激素(fGH),采用RT-PCR方法,从银狐垂体中扩增fGHcDNA基因,利用SnaBI和NotI位点将fGH基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽的下游,构建成fGH基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/fGH,载体经SalI酶切线性化后,通过电转移将线性化的pPIC9K/fGH转化到组氨酸缺陷型酵母宿主菌GS115中。然后利用不含氨基酸的以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选出高拷贝fGH基因的重组酵母,经摇瓶发酵培养和甲醇诱导使fGH进行分泌表达。结果表明本实验扩增的fGH基因序列与GenBank发表的序列基本一致,发酵液经SDS-PAGE和Western blotting检测证明构建的重组酵母能够分泌表达fGH,表达的fGH占发酵液总蛋白的34%,表达量达119mg/L发酵液。     

酿酒酵母脂肪酶基因TGL3的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

目的：克隆Saccharomy cescerevisiae脂肪酶基因,并实现其在Pichia pastoris中高效表达。方法：根据NCBIGenBank中已公布的Saccharomyces cerevisiae脂肪酶基因TGL3设计引物,以Saccharomyces cerevisiae总DNA为模板,PCR扩增目的片段,构建重组子pPIC9K-TGL3,转化到Pichia pastoris GS115。结果：扩增得到1929bp的基因片段,与GenBank中公布的序列氨基酸同源性达99.7%,编码的643个氨基酸中有脂肪酶的保守序列GXSXG,位于235～239位。重组子摇瓶发酵120h发酵液上清脂肪酶酶活达到60U/mL,酶学性质研究表明：该酶的最适作用温度为40℃,在25℃～40℃之间能保持60%以上酶活力。最适pH值为8.5,在pH6.5～9.0之间能保持50%以上的酶活力。除Al3＋和Fe2＋外,该酶不受Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Cu2＋、Mn2＋、Ni＋、Sr2＋等多种金属离子的影响。结论：发酵液上清脂肪酶酶活达到60U/mL,是原菌株的10倍,成功实现了该基因的高效表达。     

人血管内皮细胞生长抑制因子在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

血管内皮细胞生长抑制因子抑制肿瘤部位新生血管的形成,切断肿瘤细胞营养供应及废物排泄通道,抑制肿瘤细胞恶性增殖。将编码成熟的人血管内皮细胞生长抑制因子基因克隆到表达载体pPICZα中,电转化P.pastorisGS115菌株,抗生素ZeocinTM浓度梯度筛选高抗性转化子,PCR筛选阳性重组菌株。经表型鉴定后,用甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹杂交结果证实了表达产物为重组人血管内皮细胞生长抑制因子-his6融合蛋白,表达量约为5mg/L。经细胞毒性试验测定,表达产物对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖具有较明显的抑制作用。     

元宝枫蛋白酶的分离纯化及其生化性质

采用有机溶剂沉淀和柱层析方法,从元宝枫(Acer truncatum Bunge)叶片中提取并纯化了叶蛋白酶.该蛋白酶的比活性为1 408.04 U·mg-1,纯化倍数50.77.以酪蛋白为底物时,该蛋白酶最适pH 7.5,最适温度60℃;该蛋白酶在pH 5.0～pH 10.0范围内以及在60℃以下较为稳定.该酶的活力能被半胱氨酸和EDTA激活,但受HgCl2抑制,具有巯基蛋白酶的特性.     

Expression and characterization of soybean seed coat peroxidase in Escherichia coli BL21(DE3)

Soybean seed coat peroxidase (SBP) is a valuable enzyme having a broad variety of applications in analytical chemistry, biochemistry, and food processing. In the present study, the sscp gene (Gene ID: 548068) was optimized based on the preferred codon usage of Escherichia coli, synthesized, and expressed in E. coli BL21(DE3). SDS-PAGE and western blot analysis of this expressed protein revealed that its molecular weight is approximately 39?kDa. The effects of induction temperature, concentration of isopropyl-β-D-thiogalactoside and hemin, induction time, expression time were optimized to enhance SBP production with a maximum activity of 11.23?U/mL (8.64?U/mg total protein). Furthermore, the kinetics of enzyme-catalyzed reactions of recombinant protein was determined. When 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) was used as substrate, optimum reaction temperature and pH of the enzyme were 85°C and 5.0, respectively. The effects of metal ions on the enzymatic reaction were also further investigated. The SBP was successfully expressed in E. coli BL21(DE3) which would provide a more efficient production strategy for industrial applications of SBP.     

新型耐热β-1,4-木糖苷酶的重组表达及酶学性质

【目的】拟对来源于热解纤维素果汁杆菌的新型β-木糖苷酶基因（CoXyl B）进行重组表达和酶学性质研究。【方法】在大肠杆菌系统中成功表达CoXyl B基因,并通过镍柱亲和层析、强阴离子交换和凝胶层析等纯化方法获得纯酶。【结果】对CoXyl B酶学性质的研究结果显示,在以4-对硝基苯酚-β-D-木糖苷为底物时,该酶的最适反应温度为90℃,最适反应pH为6.0。在40–70℃范围内CoXyl B酶活较高且比较稳定。在pH 5.0–6.0之间,70℃孵育1 h后,CoXyl B的相对酶活仍保留80%以上。Ag⁺、高浓度的SDS和PMSF对酶活力的抑制作用较显著,而高浓度Mg²⁺、Li⁺和EDTA对酶活力的激活作用较为明显。CoXyl B的k_cat和K_m值分别为5.0×10^–3s^–1和1.9 mmol/L。薄层层析色谱显示CoXyl B具有降解木二糖、木三糖和木四糖的能力。【结论】本研究鉴定出CoXyl B为一种新型的极端耐热木糖苷酶,CoXyl B的酶学性质研究将为其在食品热加工以及生物降解领域中的应用提供参考。     

里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用外显子拼接的方法,以里氏木霉Trichoderma reesei基因组 DNA 为模板,克隆出内切-1,4-β-D-葡聚糖酶II基因egl2的全编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pQY2025。重组质粒线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达内切葡聚糖酶II的毕赤酵母工程菌株Gp2025。用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,培养基中内切葡聚糖酶II的活力可达1573.0U/mL,同时对重组内切葡聚糖酶II的性质进行了初步研究。     

Ammonia affects the glycosylation patterns of recombinant mouse placental lactogen-I by chinese hamster ovary cells in a pH-dependent manner

The N-linked glycosylation of the recombinant protein mouse placental lactogen-I (mPL-I) expressed by Chinese hamster ovary (CHO) cells under nongrowth conditions was inhibited by increasing levels of ammonium chloride (3 and 9 mM) in a serum-free, protein expression medium. The effect of ammonia on glycosylation was dependent on the extracellular pH (pH(e)). In media containing 0 and 9 mM ammonium chloride, the percentage of the most heavily glycosylated forms of secreted mPL-I decreased from ca. 90% to ca. 25% at pH(e) 8.0, and from ca. 90% to ca. 65% at pH(e) 7.6, respectively. However, at pH(e) 7.2, the most heavily glycosylated forms of secreted mPL-I decreased from ca. 90% to ca. 80% in media containing 0 and 9 mM ammonium chloride, respectively. Inhibition of mPL-I glycosylation was found to correlate with the calculated concentrations of the ammonia species (NH(3)). Control experiments showed that the ammonia effect on mPL-I glycosylation could not be attributed to increased chloride concentration or osmolarity, or to extracellular events after secretion of the recombinant protein into the supernatant. Ammonium chloride, 9 mM, inhibited the expression rate of MPL-I by CHO cells at low pH(e). (c) 1994 John Wiley & Sons, Inc.