ENU诱导点突变——大规模基因突变和功能研究

ENU诱导点突变正在成为一种大规模基因功能研究的有效手段。这里介绍了ENU诱变的机制、影响诱变效率的因素、ENU诱变的策略、表型的筛选、点突变的鉴定以及相关的研究和取得的一些最新进展。     

南昌霉素高产菌株的链霉素抗性基因突变诱变筛选研究

通过对链霉素对南昌霉素（Nanchangmycin)产生菌NS－41－80菌株孢子的致死浓度测定基础上,采用诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）的不同诱发剂量对菌株孢子进行诱变处理,诱变处理的孢子涂布在含链霉素（10ug/mL)致死浓度的高氏平板上,获得了大量的链霉素抗性基因（str)突变株。然后从3,000株链霉素抗性基因（str)突变株中通过初筛获得比诱变出发菌株产素能力提高20％以上的菌株202株,再进一步通过摇瓶复筛,获得比出发菌株产素能力分别提高100％,200％,300％高产菌株为48株,7株和1株,分别为复筛菌和初筛菌株的23．76％和1．60％,3．46％和0．23％,0．5％和0．03％,将产素能力提高240％以上5个菌株连同出发菌株连续3批次进行摇瓶发酵结果,5个突变株的产素能力均比出发菌株的产素能力提高57％－96．4％,其中突变株80－5．3－165菌株摇瓶发酵单位达6,000ug/mL以上,3批次摇瓶平均发酵单位达5,855ug/mL,建立了南昌霉素高产菌株的链霉素抗性基因突变诱变快速高效的筛选方法。     

可见（激）光诱变效应分子机理研究：脂质过氧化活性产物在基因突变中的作用

可见激光诱变效应应用于作物育种,已有大量报道。已有实验报告,光敏化作用亦可造成细胞基因结构与功能的改变。众所周知,可见光不能被DNA吸收,而常用的光敏剂如HPD等主要滞留在细胞膜和胞质中,何以引起基因损伤？其机理至今尚不清楚。一些研究表明,引起突变效应的光辎射,同时导致股脂质过氧化反应发生,并且抗突变和抗脂质过氧化具有一致性,提示可见光突变效应可能与脂质过氧化活性产物有关。在生物物质中都会有大量的不饱和脂肪酸,它们主要在膜脂质中,使各种细胞膜对外界理化因素具有高度敏感性,从而导致脂质过氧化链式反应…     

功能基因组学的研究方法

基因组学的研究已从结构基因组学转向功能基因组学,功能基因组学时代对于基因功能的研究也由单一基因转向大规模,批量分析,本综述了功能基因组学的研究内容与方法,主要包括：差异显示反转录PCR,基因表达序列分析（SAGE）,微点阵,遗传足迹法,反求遗传学,蛋白质组学和生物信息学等新方法。     

昆虫击倒抗性基因突变对钠通道功能的影响

该文综述了昆虫钠通道基因的表达与功能特性、击倒抗性突变的功能和这些突变对钠通道门控的影响,以及钠通道基因突变与抗性表现型之间的因果关系;还讨论了这些突变增强击倒抗性的分子机理。     

ENU诱导带LacZ靶基因的λgt11 DNA突变分子机理的初步研究

采用ENU(乙基亚硝基脲)作用于裸露的λgt11 DNA,经体外重包装,转染宿主菌 E. coli Y1090,在含底物X-gal,诱导剂IPTG的选择性培养基上铺皿,发现被处理的λgt11 DNA除了使噬菌体存活率下降外,还出现了靶基因"LacZ"较高频率的突变.其中以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂,当存活率分别为3.5×10-3、1.6×10-3和5.5×10-4 时,相应的突变率依次为1.1×10-3、3.2×10-3和5.2×10-3,DMSO溶剂对照突变率则<5.0×10-5 .对ENU诱导的5个阳性突变体进行了扩增,以PCR产物为模板,采用正向引导,对阳性突变体靶基因LacZ进行了部分测序,在被测序的260bp范围内,发现了9个位点的碱基突变.碱基突变的类型有颠换(67%)、转换(11%)和移码突变(22%).颠换主要以A→T、G→C为主.似乎胞嘧啶(C)更易发生突变(占43%).     

大肠杆菌乙酸代谢突变株的选育和特性研究

在大肠杆菌高密度培养中 ,因代谢副产物乙酸积累 ,导致抑制菌体的生长和产物表达的下降。为减小乙酸的抑制作用 ,采用60 Co诱变处理大肠杆菌JM1 0 1 ,结合连续培养 (含乙酸钠选择压力 )定向富集方法 ,选育到一株乙酸耐受性增强的菌株JL3。该菌株表现出明显的乙酸耐受性的提高 ,在含有 1 0 g/L乙酸钠的MA培养基中 ,菌体生长和葡萄糖消耗速率都有较大程度提高 ,并且具有良好的遗传稳定性     

华丽蛇毒素RGD序列上游点突变对结构和功能的影响分析

解联蛋白（disintegrin)是一类存在于蛇毒中的血小板凝集抑制因子。研究表明,Arg-GLT-Asp(RGD)序列与解联蛋白的生物学活性有密切关系。紧靠RGD序列两翼的氨基酸残基有调节解联蛋白抑制ADP-诱导血淖板凝集作用,RGD序列侧翼的第45位氨基酸残基位于该类蛋白内部形成的小槽内,这个小槽在RGD袢形成发夹结构方面起重要作用,在此基础上,本文进一步分析了RGD袢形成发夹结构方面起重要作用,在此基础上,本文进一步分析了RGD袢上游区域氨基酸残基在调节解联蛋白功能中的作用。具体方法是：用基因点突变技术将华丽蛇毒素的K^41K^42K^43R^44T^45I^46突变腹蛇毒素的S^41K^42A43G44T45I46和S^41K42A43G44I46。然后分析突变蛋白的结构。性质和功能变化。结果表明,前一种突变K^41K42A^43R^44T45I46→S^41K^42A^43G^44T^45I^46显著地降低了华丽蛇毒素对血小板凝集和抑制活性,后一种突变S^41K^42A^43G^44T^45I^46→S^41K^42A^43G^44I^46有效地恢复了华丽蛇毒素抑制血小板凝集的作用。同时,这两种突变也改变了含点突变基因的pGEX-3X质粒在受体细胞（E.coli)内的表达。例如,重组于pGEX-3X质粒的野生型腹蛇毒基因和华丽蛇毒素基因以可溶性形式表达,而重组于相同载体的点突变基因表达的目的蛋白是不溶性的,为此,本文又通过构建表达难溶蛋白载体的方法获得了突变基因的可溶性表达产物。本文首次证实了RGD上游的39-45位氨基酸残基与解联蛋白的结构和功能有密切关系。     

插入突变在功能基因组学研究中的应用

插入突变库的构建是功能基因组学研究的一个重要内容,可为确定基因的功能提供最直接的证据。构建插入突变库的方法有T-DNA插入突变、转座子插入突变和质粒介导的插入突变。本文分别介绍三种方法的原理及其在功能基因组学研究中的应用和研究进展。     

临床分离纹带棒状杆菌喹诺酮类耐药株gyrA和parC基因突变的研究

目的 探讨gyrA 、parC基因的改变与纹带棒状杆菌耐喹诺酮类抗生素的关系.方法 采用微量稀释法测试纹带棒状杆菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星、万古霉素的敏感性.PCR扩增检测gyrA和parC基因喹诺酮类耐药决定区相关片段并测序,在GenBank中进行Blast及BlastX分析并观察氨基酸突变位点,用NcoI酶进行PCR-RFLP.结果 37株纹带棒状杆菌对环丙沙星和左旋氧氟沙星的耐药率为94.6％,30株菌发生双突变(87位Ser突变为phe,91位Asp突变为Ala),5株菌单点突变(87位Ser突变为phe).PCR-RFLP经NcoI酶切后显示,敏感株和耐药株均产生3个条带.结论 纹带棒状杆菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星的耐药率较高,对万古霉素全部敏感.纹带棒状杆菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制主要是gyrA突变引起的,尤以双突变占优势.纹带棒状杆菌不携带parC基因,不编码拓扑异构酶Ⅳ.     

Genetic Mapping and ENU Mutagenesis

ENU mutagenesis is a potent means to generate novel mutations in the mouse, and the further investigation of these mutations can be logistically demanding. Determination of the map position of a mutation early in its characterization can be extremely useful. We describe how the use of interval haplotype analysis can facilitate this with even small numbers of affected progeny.     

ENU诱导获得一种短尾小鼠及其突变基因的初步定位

用一种化学诱变剂ENU(乙酰基亚硝基脲 )腹腔注射 3 0只 8～ 1 0周龄C5 7BL 6J(简称B6)雄鼠 (G0代 ) ,6周后与同品系正常母鼠配种繁殖后代 (G1代 )小鼠 3 5 1只。对其后代进行筛选获得一种可遗传的显性短尾突变小鼠。为了定位该突变基因 ,运用平均分布于B6和DBA 2 (简称D2 )小鼠常染色体而在这两者间又有差异的 3 9个微卫星对突变小鼠的 (D2×B6)F1代短尾突变小鼠回交D2得到的有短尾表型的[(B6×D2 )F1×D2 ]F2 代小鼠进行基因组扫描。反向运用经典的位置候选基因法 ,将短尾突变基因定位于 1 7号染色体 ,与D1 7Mit3 3的LOD值为 9 0 8。选用该染色体上与短尾表型相关基因Brachyury (T)最近的微卫星D1 7Mit1 43引物扩增 ,在 1 0 9只F2 代短尾小鼠中未发生一例交换 ,表明Brachyury基因是本例短尾突变强有力的候选基因。     

乙酰基亚硝基脲诱导小鼠突变的初步研究

目的　探索乙酰基亚硝基脲 (ENU)诱导小鼠突变的效率 ,筛查并获得能显性遗传的突变型小鼠。方法　采用 8～ 10周龄的雄性C57BL 6小鼠 33只、DBA 2小鼠 18只 ,腹腔注射ENU10 0mg kg ,每周一次共三次 ,与同品系母鼠配种 ,在后代小鼠中针对可见表型筛查突变个体。结果　处理雄鼠有 9至 13周的不育期 ;在已经筛查的12 4 1只小鼠中得到眼睛异常、多趾、少趾及腹部白斑、矮小等突变个体 6 1只 ,突变率约 5 % ;获得单基因显性遗传的突变品系 2种。结论　ENU为小鼠的强诱突变剂 ;通过诱变可以得到遗传突变小鼠 ,为建立人类疾病动物模型提供条件 ;大规模诱变实验对小鼠功能基因组的研究有重要意义     

斑马鱼反转录病毒插入突变技术的发展及其在基因饱和突变与筛选中的应用

用于大规模基因突变与筛选的主要策略有化学诱变、插入突变、基因诱捕。插入突变是一种通过外源DNA整合的方式来获得突变体,并克隆得到对应突变基因的方法。运用反转录病毒介导的插入突变技术,在脊椎动物斑马鱼中已经获得了许多影响胚胎发育和细胞生长过程的突变体,并找到了对应的基因。基因诱捕技术也被运用于反转录病毒载体的构建。这套系统的建立使斑马鱼成为第一个有可能达到基因饱和突变和筛选的脊椎动物。     

ENU诱变获得一种多趾小鼠及其突变基因的鉴定

采用化学诱变剂乙酰基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)获得一种常染色体显性遗传多趾突变小鼠(Mus musculus),该突变小鼠在后趾内侧(即轴前部)多出一个脚趾,且严重程度不一,部分小鼠双侧后足都有多趾表型。阿尔新蓝-茜素红染色结果表明,多趾突变杂合子小鼠除多趾异常发育外,其余骨骼无明显异常。为定位该突变基因,利用微卫星标记对(C57BL/6J×DBA/2J)F1代多趾突变小鼠回交C57BL/6J得到的[(C57BL/6J×DBA/2J)F1×C57BL/6J]N2代多趾小鼠进行全基因组扫描,最终将本例多趾突变基因定位于小鼠第2号染色体微卫星D2mit45与D2mit184之间,并初步确定Alx4为该突变候选基因。在此基础上对Alx4进行测序分析,测序结果发现突变小鼠Alx4基因编码区第433位碱基处发生A到T的颠换,导致编码区第145位密码子AAA(编码赖氨酸)变为终止密码子TAA,引起蛋白编码提前终止,是引起多趾表型的原因。     

Implementing Large-Scale ENU Mutagenesis Screens in North America

A step towards annotating the mouse genome is to use forward genetics in phenotype-driven screens to saturate the genome with mutations. The purpose of this article is to highlight the new projects in North America that are focused on isolating mouse mutations after ENU mutagenesis and phenotype screening.     

人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究

目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。     

木聚糖酶基因克隆、表达与分泌及定点诱变研究进展

木聚糖酶专一性水解木聚糖分子中β14糖苷键,在制浆造纸、食品、纺织、饲料、能源工业中具有广阔的应用前景。随着各种新技术的发展与应用,木聚糖酶基因的研究取得了很大进展,不仅克隆了许多不同来源的木聚糖酶基因,研究了木聚糖酶基因在同源和异源寄主中的表达和分泌,而且还使用定点诱变技术探讨了木聚糖酶的结构与功能的关系并对酶的性质进行改造以满足工业生产的需要 。     

溶藻菌株NP23的紫外诱变选育

应用紫外诱变技术对溶藻菌株NP23进行紫外诱变处理。经过粗筛后,从8株诱变株中选出2株对绿藻中小球藻和蓝藻中惠氏微囊藻的去除效果明显优于原始菌株的突变株NP23-1和NP23-4,其溶藻率(叶绿素a的去除率)比原始菌株提高30%-35%。连续6代测试,2株诱变菌株NP23-1和NP23-4溶藻率都很稳定,表明所得突变株是比原始菌株更优秀的溶藻菌株。     

植物病毒诱导的基因沉默在基因功能研究中的应用

传统的植物遗传转化方法周期长、工作量大、过程繁琐,不利于基因功能的快速高通量鉴定．近年来随着基因沉默机制研究的深入和不断发展,利用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)进行植物功能基因组研究作为一种快速、高通量的反向遗传学工具已被广泛应用在烟草、马铃薯、番茄等植物中, 在大规模的植物基因组功能鉴定中展示了广阔的应用前景．综述了 VIGS 的作用机制、植物病毒栽体、转化方法以及在植物基因功能研究等方面的应用及前景．