大鼠热休克蛋白70的融合表达及纯化鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化大鼠热休克蛋白（HSP）70与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白,以进一步研究细胞外HSfr70的生物学功能。方法：用RT-PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体转化大肠杆菌B121,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,建立最佳诱导表达条件;采用Amylose树脂预装柱对目的蛋白进行亲和纯化,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果：克隆出目的基因,构建了融合表达载体pMAL-c2X／hsp70;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带,并纯化出纯度较高的融合蛋白;免疫印迹鉴定表明其具有抗原活性。结论：在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白MBP-HSP70,为进一步研究细胞外HSP70的生物学效应提供了有用的材料。     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因的克隆及表达

目的：克隆人胰高血糖素样肽-1突变体（^2Gly-hGLP-1)基因,高效表达GST-^2Gly-hGLP-1融合蛋白.方法:在获得重组hGLP-1基因工程菌基础上,利用定点突变技术改造其第2位丙氨酸为甘氨酸,经酶切克隆于pGEM-7z( )载体中,构建pGEM-4T-3/^2Gly-hGLP-1融合表达规模.SDS-PAGE和凝胶扫描分析,融合蛋白以可溶形式存在,其表达量占菌体总蛋白的29.7%。表达产物经亲和层析纯化后纯度在95%以上,免疫印迹证实,该融合蛋白可被异性hGLP-1（7-37）抗体所识别。结论：为产业化规模制备hGLP-1突变体提供技术线路。     

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的IgC2结构域蛋白的原核表达和纯化

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4基因是新克隆的脑瘤相关基因,采用多聚酶链式反应（PCR）方法获得长约500bp含IgC2结构域的DNA序列,扩增产物克隆至pGEX-4T-2质粒中,构建GST融合表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经包涵体沉淀,溶解,Glutathione-Sepharose亲和层析纯化获得融合蛋白,并以Western blot鉴定证实,通过IgC2结构域蛋白的纯化分离该结构域,为进一步研究该结构域及LRRC4基因的结构和功能奠定了基础。     

MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E^rns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的：利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定。方法：用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用（G4-S）3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-Erns-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白,并对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76800;Western blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力。结论：BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

便于产物纯化的融合表达载体的构建

本文构建了便于目的产物纯化的融合表达载体pBG-2,即在pBV220质粒的P_RP_L启动子下游插人链球菌荡白G的IgG F_c结合区基因片段（编码60个氨基酸）,该插人片段下游仍保留多克隆位点并引人剪切融合蛋白的特异位点．SDS-PAGE显示,在大肠杆菌中融合基因片段能表达到占菌体总蛋白的30%的水平,Western-blot结果表明,表达产物能很好地与IgG结合．     

蛋白酪氨酸激酶NOK／STYK1胞内区的表达与纯化

目的：酪氨酸蛋白激酶NOK／STYKl具有很强的促肿瘤形成和转移能力,被认为是很有前途的肿瘤治疗靶点。由于NOK含有一个跨膜区,且富含疏水性氨基酸,其表达和纯化非常困难,直接影响了对其功能及相关分子机理的深入研究。本研究目的是获得可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白ANOK（AA：49—422）,为后续抗体的制备和功能研究奠定重要基础。方法：含有△NOK基因的原核表达载体,转入E-coliBL21中,IPTG诱导蛋白表达,通过亲和层析获得可溶的△NOK融合蛋白。融合蛋白经凝血酶酶切后,凝胶过滤层析分离标签蛋白获得z~NOK蛋白。同时,我们还通过Bac-to-Bac系统获得含有ANOK基因的杆状病毒,感染sO细胞,尝试在真核细胞中表达目的蛋白。结果：通过在sf9昆虫细胞和大肠杆菌表达系统中盐浓度等各种条件的摸索,首次获得了可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白（ANOK—GST）和一定量去除标签的ANOK蛋白。本研究中与大肠杆菌相比,昆虫细胞并不适合△NOK的纯化。结论：我们建立了一套优化的NOK蛋白表达和纯化体系,从而为后续抗体制备和各种体内外生化实验等功能研究奠定基础,为研究NOK在肿瘤中的作用和药物筛选创造条件。同时丰富了整个RTKs家族作用机制的探索,进一步促进了以RTKs为靶点的治疗手段在临床上的应用。     

融和蛋白GST-SUMO-MT在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

将编码融合蛋白GST-SUMO-MT的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-GS-MT并转化到大肠杆菌Origami（DE3）中。20℃,1mM的IPTG诱导20h后,获得分子量约为43Kd的融合蛋白,表达量占菌体上清总蛋白的38.4％。利用谷胱甘肽交联琼脂糖（Glutathione Sepharose 4B）凝胶柱和Sephardex G-25分子筛联用可以得到纯度为95%以上的融合蛋白,得率约为70mg/L。该融合蛋白可与GST抗体产生阳性反应。融合蛋白GST-SUMO-MT可以显著提高宿主对Cd2+、Zn2+和Cu2+离子聚积的能力,其耐受能力比对照组分别提高4.2倍、4倍及1.6倍。此外,原子吸收光谱法测定,每分子GST-SUMO-MT可以结合2-3个Cd2+离子。     

小鼠CSRP2基因的克隆、融合表达及蛋白的分离纯化

目的：获得小鼠CSRP2（cysteine rich protein2）基因片段,高效表达、纯化CSRP2。方法：用RT-PCR技术从小鼠心脏组织中提取总DNA并扩增出相应大小的CSRP2DNA片段,将其与pGEM—T—easy载体连接后测序,将测序正确的CSRP2从BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET—A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6xHis融合蛋白,对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化。结果与结论：PCR获得的C职咫序列与GenBank报道的一致（为675bp）;重组载体在大肠杆菌BIJ21中以包涵体形式高效表达;融合蛋白经SDS—PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约24×10^3处有特异的蛋白条带,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的25％;重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的CSRP2融合蛋白。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.