链霉菌原生质体种间融合重组的研究Ⅱ．RVA18——链霉菌原生质体种间融合重组子的一个新代谢产物

RvAl8是链霉菌原生质体种间融合(亲株为庆丰链霉菌和吸水链霉菌井冈变种)得到的一株原养型重组子所产生的一个新的代谢产物,它存在于细胞内,是一个酸性非水溶性的化合物,能溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和环已烷等,微溶于氯仿。它对革蓝氏阳性细菌和一些植物病原真菌有较强的制菌作用,能引起纹枯病菌的异常分枝。用柱层析和液相色谱相结合的方法提纯后的纯品经紫外、红外、高效液相、核磁共振、质谱等分析证明它是一个理化和生物性质均不同于=亲株产物一一井冈霉素和庆丰霉素的新代谢产物。并将RvAlB的理化、生物性质和二亲株产物井冈霉素及庆丰霉素作了比较。     

以吸水链霉菌应城变种为宿主的一系列基因克隆体系的发展

对链霉菌分子生物学的兴趣有一个十分突出的特点,就是人们感兴趣的菌种非常广泛,这个特点出自对不同的抗生素和细胞外酶生物合成遗传调控研究的需要。吸水链霉菌应城变种就是这类有趣菌种中的一员。 吸水链霉菌应城变种具有下述有趣的特征:(一)它产生三种不同结构的农用抗生素,一种为氨基糖苷类抗生素,与有效霉素A(Validamycin)的结构相类似,对水稻病原菌中的丝核菌类(如纹枯病,小核菌核病),具有良好防效。     

影响链霉菌原生质体形成、再生的因素

本文报道生长培养基成份,菌丝生育期,溶菌温度及再生培养基成份等对庆丰链霉菌,吸水链霉菌井冈变种原生质体形成和再生的影响,结果表明: 1.生长培养基中添加适量甘氨酸,和/或蔗糖,能增加菌丝细胞壁被溶菌酶消化的敏感性。2.对数生长期菌丝比静止期菌丝原生质体的再生活性高得多。3.菌丝溶解温度庆丰链霉菌以28℃为宜,吸水链霉菌井冈变种则以32℃为最适。4.再生培养基中高渗稳定剂的浓度对原生质体再生影响很大,对吸水链霉菌井冈变种来说,再生培养基R_2YE中的蔗糖以0.3M为宜,R_3中的琥珀酸钠以0.2M为宜。文中并对甘氨酸,蔗糖的作用机理及不同链霉菌原生质体制剂中含有不同比例的渗透敏感单位(即真正原生质体)的可能原因进行了讨论。     

链霉菌原生质体种间融合——产抗生素的耐温型重组子的选育

以庆丰链霉菌(SM^r,42℃不能生长,产庆丰霉索,可抑制细菌生长)与吸水链霉菌井冈变种(sM5,42℃生长良好,产井冈霉素,不抑制细菌生长)为亲株,在42％PEGl000诱导下进行原生质体融合,在含SM 100μg／ml,42℃培养的再生平板上直接选择耐温型融合子,融台率为1O^-5—1O^－4左右,经分离传代后可得到稳定的耐温型的单倍体重组子,即可在42℃生长,并且有链霉素抗性和抑制细菌生长的活性。初步测定了四个重组子产生的抗菌物质的性质,都与亲株产生的庆丰霉素、井冈霉素不同,其中F1－38,F1－16和IFM3－32三个重组子的抗生素在波长274mm处有一个紫外吸收小峰,而重组子F6-6有二个活性部分,其一在紫外线下呈荧光,另一则具有酸碱指示剂特性。     

紫外分光光度法测梧宁霉素中有效成份的研究

紫外分光光度法测梧宁霉素中有效成份的研究杜国民，张秀华，李凤忱，张宪丽（辽宁省微生物研究所，朝阳１２２０００）梧宁霉素（以下简称１１３７１）是辽宁省微生物研究所筛选的一株不吸水链霉菌梧州亚种经发酵产生的抗生素；其主要成份有四种，即四霉素Ａ、四霉素Ｂ、...     

链霉菌耐温型种间融合重组子淀粉酶热稳定性的比较研究

通过庆幸链霉菌M15S与吸水链霉菌井冈变种~#75菌株的原生质体种间融合,得到稳定的耐温型重组子F1-38和F6-6等,其生长的上限温度分别为53℃和63℃,而亲株M15S和~#75则分别为39℃和50℃。将这两个重组子产生的淀粉酶的耐温性与双亲株的淀粉酶相比较表明,这两个耐温型重组子淀粉酶的热稳定性均高于亲株;随着菌体培养温度的提高,淀粉酶的热稳定性增加,一些重组子的淀粉酶活力大大提高。     

吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建

吸水链霉菌NND-52-C菌株是大环内酯类抗生素-阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术,将来自变铅青链霉菌TK24菌株的pU702质粒转化吸水链霉菌NND-52-C菌株的原生质体,建立了吸水链霉菌NND-52-C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND-52-C菌株原生质体制备和再生的条件,其原生质体形成率达到10^8／mL,再生率约为0．2％,转化率为10^2-10^3个转化子／μg质粒DNA。     

链霉菌耐温型种间融合重组子淀粉酶热稳定性的比较研究

通过庆丰链霉菌M15S与吸水链霉菌井冈变种^#75菌株的原生质体种间融合,得到稳定的耐温型重组子F1-38和F6-6等,其生长的上限温度分别为53℃和63℃,而亲株Ml5s和~#75则分别为39℃和50℃。将这两个重组子产生的淀粉酶的耐温性与双亲株的淀粉酶相比较表明,这两个耐温型重组子淀粉酶的热稳定性均高于亲株;随着菌体培养温度的提高,淀粉酶的热稳定性增加,一些重组子的淀粉酶活力大大提高。     

一种与抗生素调控基因afsk高度同源的新基因——Spy1的克隆

普那霉素是由始旋链霉菌产生的一种链阳性菌素 类抗生素.目前国外对普那霉素的基因工程研究甚少,国内尚属空白,这阻碍了利用基因工程 的方法来提高普那霉素产量的发展.本文通过对普那霉素产生菌——始旋链霉菌柯斯基因组 文库的构建和菌落原位杂交,筛选出了与普那霉素高产密切相关的新基因所在的柯斯质粒,并通过 酶切分析和Southern杂交确定了该基因所在的酶切片段,对酶切片段进行亚克隆测序,获得了 与天蓝色链霉菌中抗生素调控基因afsk同源新基因的全长克隆,该新基因包含有1个2 127 bp的开放阅读框(ORF),编码708个氨基酸的蛋白,命名为Spy1.对该新基因的生物信息学初步分析表明,该基因编码的是丝/苏氨酸蛋白激酶.     

吸水链霉菌NND-52-C基因工程宿主载体系统的构建*

吸水链霉菌NND-52-C菌株是大环内酯类抗生素 阿扎霉素B的高产菌株。采用原生质体转化技术 ,将来自变铅青链霉菌TK2 4菌株的pIJ70 2质粒转化吸水链霉菌NND-52-C菌株的原生质体 ,建立了吸水链霉菌NND-52-C菌株的基因工程宿主载体系统。确定了NND-52-C菌株原生质体制备和再生的条件 ,其原生质体形成率达到 10⁸个 mL ,再生率约为0.2 % ,转化率为10²～10³个转化子 μg质粒DNA。     

链霉菌原生质体种间融合重组的研究 I．庆丰链霉菌和吸水链霉菌井冈变种的种间融合

本文报道庆丰链霉菌AS20l[11v]、MS30[Pr0一Ade—sm r］菌株和吸水链霉菌井冈变种VA4[His-]菌株原生质体的种间融合重组。AS201×vA4融合产生由二亲株营养标记互辅的稳定的原养型重组子,频率为1．09×10^-5．98×10^-6MS30 xvA4融台产物除原养型重组子,重组频率为5．7×10^-5外,还出现异核体及异质无性系(频率为2．8×10^-4一2．14×10^-5)。得到的原养型重组子,在孢子颜色、抗药性状、产物性质等方面显现广泛多样的变异。从中得到一个原养型重组菌株RvAl8,它所产生的抗菌物质,理化和生物性质与亲株产生的庆丰霉素和井冈霉素明显不同。     

庆丰链霉菌SQP1质粒的种间转移和表达

庆丰链霉菌A201菌株的SQP1质粒可以通过混合培养接合转移到井冈链霉菌VA4菌株的细胞中,转移频率为2—8％。接合子p菌株的形态特征和亲株VA4相似,但却获得了产生抑制细菌的抗生素的能力,这种抑制细菌的能力在遗传上是稳定的。高温预培养能使接合子P2菌株抑细菌活性受到消除,消除频率达10％以上。鉴定P2接合子的发酵产物证明包含二个抗菌物质,一个是它本来的产物井冈霉素,另一个是新获得的抑制细菌物质庆丰霉素,后者的产生是由于SQP1进入新寄主细胞的结果。     

吸水链霉菌HS023 milF基因敲除构建产5-酮米尔贝霉素基因工程菌

【目的】通过敲除吸水链霉菌HS023的mil F基因,构建产5-酮米尔贝霉素的基因工程菌。【方法】构建mil F基因敲除质粒p MSST-Δmil F,转入米尔贝霉素产生菌——吸水链霉菌HS023,获得mil F基因敲除的双交换突变株F2-18。【结果】发酵结果表明:mil F基因敲除突变株F2-18不再产生米尔贝霉素,仅产生中间产物5-酮米尔贝霉素,且发酵单位较出发菌株略有提升。【结论】通过敲除mil F基因,发酵可生产5-酮米尔贝霉素,并直接用于驱虫药米尔贝肟和乐平霉素的化学合成,可大大简化从米尔贝霉素到米尔贝肟和乐平霉素的合成步骤。     

农用抗生素“11874”产生菌的鉴定

从我国江西省井冈山地区的土壤中,分离得到一株拮抗性放线菌11874,它所产生的抗生素(农抗“11874”)对小麦腥黑穗病有较好的防冶效果。通过形态、培养特征、生理生化特性及细胞壁组份的研究,证明该菌株为链霉菌属中的一个新变种,定名为不吸水链霉菌井冈山变种(Streptomyces ahygeoscopicus var. jiuggaugshaueuus n．Var)     

吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997中噬菌体基因转移系统的建立及其应用

由吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997产生的格尔德霉素geldanamycin(GA)属安莎类抗生素,具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性。本文应用链霉菌温和噬菌体ΦC31衍生的KC515载体,在吸水链霉菌S．hygroscopicus 17997中建立并优化了S．hygroscopicus 17997的基因转染体系。利用所建立的基因转染体系,以基因阻断技术从S．hygroscopicus 17997基因文库含有多组PKS基因柯斯质粒中,鉴定了与GA PKS生物合成相关基因的柯斯质粒,该工作为GA生物合成基因簇的克隆奠定了基础。     

格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始单位的合成, 而萘醌类的AHBA基因簇可能参与未知安莎化合物的生物合成。为提高吸水链霉菌17997菌种的Gdm发酵产量, 并研究高产菌种在固体培养基上孢子的生长周期。采用基因阻断技术, 将吸水链霉菌17997中的萘醌类AHBA生物合成基因簇(shnSOP)进行破坏, 以获得DSOP菌株, 从而减少对合成所需共同底物AHBA的争夺。HPLC分析结果表明DSOP菌株Gdm的发酵产量比原株提高185%。同时, 通过孢子计数发现该菌株在固体培养基上的孢子生长经历2个周期, 第2代孢子菌种的Gdm产量较高。     

快速鉴定格尔德霉素产生菌——吸水链霉菌17997中的洋橄榄叶素

对格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997的发酵液乙酸乙酯提取物进行了硅胶板TLC 初步分离和NaOH溶液喷涂显色,对显红色、具有抗革兰阳性菌活性的条带进行了HPLC分析,提示抗革兰阳性菌活性化合物可能为大环二内酯类抗生素洋橄榄叶素;以dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶 (Tgd) 基因保守区设计PCR引物,扩增了吸水链霉菌17997基因组DNA中的tgd并进行了序列分析,表明吸水链霉菌17997含有洋橄榄叶素生物合成基因簇中的tgd基因;对NaOH溶液喷涂显红色的化合物进行LC-(+)-ESI-MS分析,证实     

吸水类群链霉菌的研究IV．两个新种的鉴定

从湖北省房县郊区土壤中分离到SH-121和SH-4两株菌。对其形态、培养特征、生理生化特性、细胞壁化学组份及DNA中G+C克分子含量进行了研究。此两株菌在高氏合成一号等培养基上均产生带成链孢子的气生菌丝体,并具有吸水现象,细胞壁化学组份I型,属于链霉菌属吸水类群,经与已知种比较,定为两个新种,命名为肉色吸水链霉菌(Streptomyces car-neohygroscopicus Zhou et Lin,nov．sp．)和团块普拉特链霉菌(Streptomtces glomeroplatensis Zhou et Lin,nov．sp．)。     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因组文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组DNA经Sau3 AI不完全酶切。回收20-30kbDNA酶切片段,与经Hpal和BamHI酶切的粘粒载体pKC505进行连接,将连接产物用噬菌体包装蛋白包装。侵染大肠埃希菌DH5α。在舍有安普霉素的LB平板上培养,所得转化子数为12000个,构建成不吸水链霉菌梧州新亚种的基因组文库。以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99％的基因组,达到了建库要求的理论值。未扩增文库的滴度为1．2×10^8pfu／L,扩增文库的滴度为4．8×10^11pfu／L,包装效率为每微克DNA1．2×10^5个转化子。随机挑取菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

子囊霉素产生菌吸水链霉菌FIM260840基因转移系统的建立

目的:建立子囊霉素产生菌吸水链霉菌FIM260840的接合基因转移体系,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。方法:以整合型质粒p SET152为出发质粒,通过接合转移构建并子囊霉素产生菌FIM260840的基因转移系统。结果:12.5μg/m L安普霉素可有效筛选接合子。经PCR验证,质粒成功整合到菌株FIM260840基因组DNA中,所获接合子的安普霉素抗性高达400μg/m L以上。接合子经多次传代后,导入的质粒p SET152仍稳定整合于接合子基因组DNA上。结论:建立了高效、简便的吸水链霉菌FIM260840的基因转移系统,为该菌的生物合成基因改造奠定了基础。