乙醇酸氧化酶基因在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

将菠菜乙醇酸氧化酶基因片段克隆至表达载体pPIC3．5k。提取重组质粒,进行限制性酶切鉴定。重组质粒用Sal I酶切线性化,电导入法转化毕赤酵母(Pichia pastoris),在缺乏组氨酸的RDB平板筛选重组子,提取酵母的染色体基因组进行PCR扩增鉴定整合情况,用甲醇诱导表达。结果表明,SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的分子量约为39．8kD,与文献报道的乙醇酸氧化酶分子量接近。酶的活力达到了40．8IU／g湿菌体,比不含有目的片断的对照菌酶活提高了17倍,确认了导入的乙醇酸氧化酶基因片段在酵母中高效表达。     

内生多粘芽孢杆菌EJS-3纤溶酶基因在毕赤氏酵母中的表达

以自构建的重组质粒pET-DsbA/PPFE-I为模板,扩增内生多粘芽孢杆菌纤溶酶基因PPFE-I,构建Pichia pastoris表达载体pPICZαA/PPFE-I,通过电击转化,pPICZαA/PPFE-I 被整合到Pichia pastoris SMD1168基因组中,抗性筛选得到的阳性转化子,用终浓度为1%甲醇诱导72 h,酶活达到286 IU/ml,是野生菌的2.6倍,表达产物用SDS-PAGE进行分析,在相对分子质量63 kDa处出现明显的蛋白条带,降解人血纤维蛋白试验中rPPFE-I最先降解人血纤维蛋白原的α链,其次是β链,而对γ链降解最缓慢。实现了多粘类芽孢杆菌纤溶酶基因在毕赤酵母中的表达,为植物内生菌来源溶栓药物的开发提供了新的途径。     

牛乳铁蛋白N-叶在毕赤氏酵母中的高效表达及抑菌性

[目的]本研究将牛乳铁蛋白的N-叶(BLF-N)克隆至毕赤氏酵母菌基因组中,通过密码子优化和发酵条件优化,实现BLF-N的异源高效表达,研究重组BLF-N的抑菌功能.[方法]本文以BLF基因为模板,按照毕赤氏酵母的密码子偏好性进行密码子优化,构建重组表达载体pPIC9K-UBLF-N,电击转化到 Pichia past...     

人β-分泌酶 (BACE1) 在毕赤酵母中分泌表达及纯化

为了获得活性良好的重组人β-分泌酶 (β-secreatase, BACE1),用于研究其与抑制剂的作用模式,构建了携带β-分泌酶proBACE1和BACE1编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46,通过电击法转入毕赤酵母GS115中,分别得到重组子9k-B22和9k-B46。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达,结果显示9k-B22的上清活性明显高于9k-B46的上清活性。9k-B22表达上清浓缩后经HisTrap亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的BACE1活性, SDS-PAGE/高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白,并且其糖基侧链可以被Endo Hf完全切除,得到50 kDa左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现,这两个蛋白分别与proBACE1和BACE1匹配。活性检测发现糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK-293细胞表达的商品BACE1,这说明糖基化及其类型对BACE1的活性非常重要。然而已知的BACE1抑制剂对三者的抑制率无显著差异,这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化BACE1纯化产量提高到1 mg/L,这为发现并优化BACE1新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。     

SMAD4在嗜甲醇酵母中的表达及鉴定

Ｓｍａｄ４是新近发现的一种肿瘤抑制基因。在５０％的胰腺癌和３０％的结肠癌中,此基因发生突变或缺失。利用Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统,以胞外分泌的方法表达了ＳＭＡＤ４蛋白,并对ＳＭＡＤ４蛋白的生化性质进行了分析。结果显示表达蛋白的分子量约６７ｋＤ,经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定,与ＳＭＡＤ４抗全有特异的结合反应,Ｎ末端１３个氨基酸的序列与Ｓｍａｄ４ ｃＤＮＡ推断的序列完全一致。     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据质粒pPIC9K中信号肽基因和质粒pPIC3.5K/hTα1-RP,构建表达质粒pPIC9K/S-hTα1-RP,通过电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达。     

人肝细胞生长因子(hdHGF)基因在毕赤酵母中的分泌表达

研究了hdHGF基因在毕赤酵母中的表达 .以人胎盘mRNA为模板 ,经逆转录、重叠PCR获得hdHGF全长和成熟基因片段 .将该基因片段克隆到pPIC9载体上 ,将重组表达质粒转化巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115,筛选mut+ 表型 ,经甲醇诱导可实现rhdHGF的分泌表达 .经摇瓶培养筛选出 4株表达水平较高的酵母工程菌株 ,SDS PAGE分析和Western印迹试验表明 ,产物分子量约为80kD ,5L发酵罐高密度培养已使生物量达 13 5g L(干重 ) ,发酵液上清总蛋白量为 8 0g L ,电泳结果表明rhdHGF表达水平为总蛋白的 12 3 % .     

受体型酪氨酸激酶PDGFRβ在毕赤酵母中的表达与纯化

构建了受体酪氨酸激酶 PDGFRβ 的融合表达载体 pPIC3.5K-PDGFRβ, 转化毕赤酵母GS115, 通过组氨酸营养缺陷型筛选, G4l8 高拷贝菌株筛选, 以及摇瓶诱导表达筛选, 得到一株高表达 PDGFRβ 毕赤酵母菌株 M3。对该菌株进行5 L罐培养, 镍柱亲和纯化在 250 mmol/L 咪唑浓度下洗下 PDGFRβ 融合蛋白, Western blot验证约为90.08 kD, 酶联免疫反应检测表明融合表达的PDGFRβ 具有高的酪氨酸激酶活性。为筛选其小分子抑制剂奠定了基础。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达

将宇佐美曲霉E001的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPXY-NII,将其经SalⅠ线性化后分别转化2株毕赤酵母GS115和KM71,xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色体上,并处于酵母α因子的下游,经筛选获得阳性重组菌PXGL98(Mut+)和PXKL29(Muts)。该木聚糖酶基因在2株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程菌的发酵条件进行了优化,在甲醇诱导下,PXGL98与PXKL29培养物上清液中的酶活力分别可达1156.92 U/mL和1646.03 U/mL。     

人睾丸前列腺素D合成酶在毕赤氏酵母中的表达、纯化及鉴定

L PGDS是一种双功能蛋白 ,即催化PGD2产生和运输亲脂 疏水分子 .L PGDS主要分布于脑和男性生殖器官 ,并分泌到脑脊液、血清、精液、尿液等体液中 .测定体液中L PGDS的含量可辅助诊断一些神经系统疾病、生殖系统疾病、心血管疾病和肾脏疾病等 .在毕赤氏酵母中表达人睾丸前列腺素D合成酶 ,以利于进一步的生物学功能及临床应用研究 .用PCR的方法从质粒pGEX 2T htL PGDS上扩增出人睾丸L PGDS成熟肽基因编码序列 ,经测序证实后 ,将其插入到质粒pPIC9中 ,构建该基因的酵母表达质粒 .电转化毕赤氏酵母GS1 1 5 ,经甲醇诱导后 ,可实现L PGDS的高效、分泌性表达 .镍离子亲合层析法对表达上清进行纯化 ,SDS PAGE分析证实 ,在 2 7kD处有重组蛋白的表达 ,表达量为 2 7mg L .纯化蛋白可与视黄酸结合 ,使其紫外吸收波谱发生红移     

猪瘟病毒E2蛋白A／D抗原区基因在酵母中的分泌表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位-B／C抗原区和A／D抗原区,设计一对特异性的引物扩增猪瘟病毒E2蛋白的A／D抗原区基因,并将PCR产物克隆入含有强启动子PAOX1和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαC中,构建成重组质粒pPICZα-AD,酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X33菌中,经Zeocin^TM筛选得到5株高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验表明酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的E2蛋白,蛋白表达量达175．8μg／mL。N-糖基化分析显示该表达蛋白在分泌过程中发生糖基化。该研究为研制防治猪瘟的亚单位疫苗与诊断试剂盒奠定基础。     

平菇漆酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

采用RTPCR技术克隆到一个平菇(Pleurotusostreatus)漆酶基因的全长cDNA,命名为lccPo1,其序列提交GenBank,登录号为AY450404。将其ORF克隆到毕赤酵母表达载体pHBM906,转化3株毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168,该漆酶基因在3种毕赤酵母菌株中均实现了分泌表达。3种摇瓶培养条件①25℃,1.0%(VV)甲醇;②20℃,1.0%(VV)甲醇;③20℃,0.5%(VV)甲醇,进行比较研究后发现适当提高甲醇浓度有利于漆酶在低温条件下表达,而降低培养温度到20℃则可以提高漆酶的产量2～6倍。3株重组毕赤酵母在其最适反应条件下测得三者粗酶液最高漆酶酶活分别为3.19UmL[GS115(pHBM565)]、2.56UmL[KM71(pHBM565)]和2.49UmL[SMD1168(pHBM565)]。对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为4.2,最适反应温度约为60℃。重组毕赤酵母GS115(pHBM565)所产酶的热稳定性稍好,在pH稳定性方面三者没有太大差异。     

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB030的内切-1,4-木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,得到重组质粒pHBM220,将pHBM220经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD1168,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达。将重组毕赤酵母KM71(pHBM220)、GS115(pHBM220)、SMD1168(pHBM220)分别诱导产酶,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为5.5,最适反应温度约为60℃。在其最适反应条件下测得三者粗酶液酶活分别为10.80IU/mL,11.63IU/mL,9.68IU/mL。重组毕赤酵母KM71(pHBM220)所产酶的热稳定性较好,而在pH稳定性方面三者没有太大的差异。     

人类抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的分泌表达和纯化

报道了一种低分子量的人类抗菌肽hepcidin基因的克隆、表达以及纯化.试验证明在毕赤酵母中能成功分泌有活性的hepcidin,hepcidin在重组菌株中的表达量约为3 mg/L,Western blot显示2.2 kD的重组hepcidin条带,重组hepcidin通过凝胶过滤及反向高效液相色谱纯化,质谱验证,重组蛋白对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性.     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

法夫酵母β-胡萝卜素转化酶(Asy)基因的克隆及可溶性表达研究

[目的]从高产虾青素的法夫酵母(Phaffia rhodozyma) 7B12菌株中克隆β-胡萝卜素转化酶基因(β-Carotene converting enzyme gene,asy),并将该基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行可溶性表达,为深入研究该酶的性质及应用提供基础.[方法]采用cDNA末端快速扩增技术,克隆得到asy基因全长cDNA序列,将其克隆到表达载体pET32a中,通过优化温度和IPTG浓度提高其可溶表达量;进一步在E.coli BL21(DE3)中共表达携带asy基因的重组质粒和pACCAR 16△crtx质粒(携带由乙酰辅酶A合成β-胡萝卜素的基因链),用液相色谱分析共转化菌株中类胡萝卜素种类的变化,鉴定可溶性表达的Asy酶活性.[结果]法夫酵母7B12菌株asy基因的cDNA序列与GenBank能检索到的唯一一条asy基因mRNA序列(Accession No.DQ002007.1)一致性达到97％,该序列总长1 971 bp,最大开放阅读框为1 614 bp,编码538个氨基酸,在E.coli BL21 (DE3)中表达的Asy融合蛋白分子量约为70 kD;条件优化后转化asy基因的重组菌在26℃、0.5 mmol/L IPTG的条件下诱导时,可溶性融合蛋白比例达85％.与pACCAR16△crtx单质粒转化相比,共转化pACCAR 16△crtx及asy基因的菌株类胡萝卜素产物的成分发生了明显的变化,其中α-胡萝卜素的含量明显减少,伴随出现了3种新的色素,根据出峰时间判断其中一种为β-胡萝卜素和虾青素的中间产物——β-隐黄质.[结论]从法夫酵母中克隆得到asy基因,通过优化诱导温度及IPTG浓度等条件提高了该基因在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达量,经鉴定可溶性的Asy融合蛋白具有转化β-胡萝卜素的活性.     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

水稻N-糖酰胺酶基因 (OsPNGase A) 的克隆及在毕赤酵母中的分泌表达

N-聚糖酶是一类广泛应用于糖蛋白的N-糖基化修饰研究中的去糖基化酶。本研究通过RT-PCR从水稻中克隆了一个高GC含量(69.48%)的N-聚糖酶基因(Os PNGase A,XM_015775832),通过无缝克隆技术构建酵母分泌型表达载体p PICZ(α)A-Os PNGase A,在毕赤酵母SMD1168H中进行诱导表达,发酵液经DEAE Sepharose阴离子交换层析和His Trap HP金属离子螯合层析纯化,产量可达到12.3 mg/L,比活力为258 U/mg。SDS-PAGE结果显示,纯化的Os PNGase A为单一条带且与预期分子量一致。Os PNGase A能作用于水稻中重组表达的人转铁蛋白(TRF)、玉米中重组表达的鸡蛋抗生物素蛋白(Avidin)以及辣根过氧化物酶(HRP),并且对Avidin的酶切效果优于商业化的PNGase F。Os PNGase A反应的最适p H和温度分别为p H 6.0和40℃,在中性和碱性以及含有100 mmol/L还原剂β-ME和DTT的条件下仍具有活性。水稻Os PNGase A的成功表达为植物糖蛋白的研究提供一个新的工具酶,酵母分泌表达体系的建立为PNGase A的大量制备奠定了基础。     

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut 表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。     

猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因在酵母中的分泌表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位-B/C抗原区和A/D抗原区,设计一对特异性的引物扩增猪瘟病毒E2蛋白的A/D抗原区基因,并将PCR产物克隆入含有强启动子PAox1和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαC中,构建成重组质粒pPICZα-AD,酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X33菌中,经ZeocinTM筛选得到5株高拷贝转化子,甲醇诱导表达.SDS-PAGE和Westernblot试验表明酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的E2蛋白,蛋白表达量达175.8μg/mL.N-糖基化分析显示该表达蛋白在分泌过程中发生糖基化.该研究为研制防治猪瘟的亚单位疫苗与诊断试剂盒奠定基础.