哺乳动物卵的激活与孤雌发育

哺乳动物卵的激活与孤雌发育范必勤,邓满齐（江苏省农业科学院,南京,２１００１４）自然界孤雌生殖是一种繁殖方式,在无脊椎动物较为普遍,脊椎动物中除哺乳类外均有孤雌生殖现象［１］。孤雌生殖（Ｐａｒｔｈｅｎｏｓｅｎｅｓｉｓ）一词最早由Ｏｗｅｎ（１８４９）提出,系指没有雄性参与,由单个卵细胞产生个体的繁殖［２］。新近重新定义为无雄性配子的任何作用,由雌性配子产生的胚胎,不论其是否发育成个体,称为孤雌生殖。     

钙离子和冈田酸对亚胺环己酮诱导小鼠卵子孤雌激活的影响

哺乳动物卵母细胞在排卵后停滞在第二次减数分裂中期,受精和多种物理或是化学刺激可以克服这一阻滞使卵母细胞活化。蛋白合成抑制剂亚胺环己酮可以诱导小鼠卵母细胞发生孤雌活化,但其机制尚未完全阐明。以前的研究提示亚胺环己酮可能是通过抑制蛋白激酶MOS的合成来发挥孤雌激活的作用的。本实验发现,CHX诱导的卵母细胞孤雌活化是Ca^2 依赖性,其效率可被钙离子载体A23187大大提高,免疫蛋白印迹结果表明,卵母细胞孤雌活化后MAPK发生去磷酸化。蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸可以克服CHX＋A23187对小鼠放母细胞活化作用,并且部分阻止MAPK去磷酸化。以上结果表明,抑制MOS的合成并非CHX诱导的孤雌活化过程的惟一原因,并且蛋白磷酸酶抑制剂可以阻断这一激活事件。     

山羊卵巢大小对卵母细胞体外成熟的影响

目的探讨卵巢大小对卵母细胞体外成熟的影响。方法根据质量将卵巢分为3组,Ⅰ组质量小于0.95 g,Ⅱ组质量介于0.95~1.7 g,Ⅲ组质量大于1.7 g,并统计了不同组卵母细胞的体外成熟率、孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率,以及克隆胚的卵裂率和囊胚率。结果 3组卵母细胞体外成熟率分别为62.25%、43.58%和40.7%;3组孤雌激活胚卵裂率分别为83.77%、82.92%和79.73%;孤雌激活胚囊胚发育率分别为19.51%、18.9%和18.78%;3组克隆胚的卵裂率分别为67.36%、65.97%和66.33%;克隆胚囊胚发育率分别为11.63%、13.41%和12.29%。Ⅰ组卵母细胞体外成熟率显著高于其余2组,3组之间孤雌激活胚卵裂率、孤雌激活胚囊胚率、克隆胚卵裂率和克隆胚囊胚发育率差异无统计学意义。结论上述结果表明来源于小卵巢的卵母细胞体外成熟率最高。卵巢大小仅影响卵母细胞的体外成熟率,对发育能力无影响。     

Gas6在猪卵母细胞及早期胚胎中表达模式与功能的初步研究

该研究通过免疫组化和QRT-PCR等方法系统分析了Gas6（growth arrest-special gene 6）基因在猪卵泡发生及早期胚胎发育过程中的表达规律,并提出了一种改良猪卵母细胞体外成熟系统的方法。研究结果显示,Gas6基因表达于猪卵巢中的卵母细胞细胞核及其周围的卵丘细胞,在卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育过程中始终有表达,且在囊胚中表达最高。Gas6 mRNA在卵母细胞成熟过程中始终存在,但在孤雌激活后迅速消失,直到发育到囊胚时再次出现。在猪卵母细胞体外培养系统中添加不同浓度的Gas6重组蛋白培养卵母细胞,发现添加Gas6重组蛋白对卵母细胞的极体率无显著影响;但是当添加浓度为100 ng/mL时,培养的卵母细胞孤雌激活后分裂率、囊胚率及囊胚细胞数都显著增高。Gas6可能是通过改善卵母细胞细胞质的成熟质量提高卵母细胞的发育潜能,从而获得了更多、更好的胚胎。     

两种激活处理促进小鼠孤雌胚胎原核形成

不同人工处理方法激活哺乳动物卵母细胞的机理相似,但其激活效率存在差异。本研究以昆明(KM)、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1雌鼠来源的卵母细胞为对象,利用氯化锶(SrCl2,Sr2+)联合细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)(Sr2++CB)和离子霉素(ionomycin,Ion)联合6-二甲胺基嘌呤(6-dimethylaminopurine,6-DMAP)(Ion+6-DMAP)两种激活方法处理下对比分析不同品系小鼠卵母细胞的激活效率,并以卵母细胞原核形成率、原核数量和孤雌胚胎体外发育来评价两种激活剂的激活效率。研究结果表明,Ion+6-DMAP激活卵的1原核比率显著高于2原核(p0.05),Sr2++CB激活卵的2原核比率显著高于1原核(p0.05);KM、129/Sv×KM F1和C3H×KM F1各组孤雌胚胎卵裂率和激活率没有显著差异(P0.05),但129/Sv×KM F1和C3H×KM F1囊胚发育率显著高于KM组(p0.05)。3种小鼠品系的卵母细胞用Sr2++CB处理的孤雌胚胎发育率显著高于Ion+6-DMAP。结果证明,Sr2++CB处理小鼠卵母细胞的激活效率明显优于Ion+6-DMAP;129/Sv×KM F1和C3H×KM F1的孤雌胚胎体外发育率显著高于KM小鼠,为研究小鼠遗传背景影响孤雌胚胎发育的机理提供参考。     

体外受精和孤雌活化过程中小鼠胚胎细胞骨架的动态变化

为研究微管在体外受精与孤雌活化过程中的动态变化,本实验比较了体外受精胚胎、SrCl2激活的孤雌胚胎和体内受精的原核期胚胎在体外发育的情况,采用免疫荧光化学与激光共聚焦显微术检测卵母细胞孤雌活化过程中及体外受精后微管及核的动态变化,以分析微管在减数分裂过程中的作用及其对早期发育的影响.结果显示,体内受精胚胎的发育率显著高于体外受精和孤雌激活胚胎体外发育率(P<0.05),而体外受精与孤雌激活胚胎在各阶段发育率差异均不显著.在体外受精中,精子入卵,激活卵母细胞,减数分裂恢复,纺锤丝牵拉赤道板卜致密排列的母源染色体向纺锤体两侧迁移;后期将染色体拉向两极;末期时,微管分布于两组已去凝集的母源染色体之间,卵母细胞排出第二极体(the second polarbody,Pb2),解聚的母源染色体形成雌原核.同时,在受精后5～8 h精子染色质发生去浓缩与再浓缩,形成雄原核.在原核形成的同时,胞质星体在雌、雄原核的周围重组形成长的微管,负责雌、雄原核的迁移靠近.孤雌活化过程中,卵母细胞恢复减数分裂,姐妹染色单体分离,被拉向两极,经细胞松弛素B处理后,活化4～6 h,卵周隙中未见Pb2,而在胞质中出现两个混合的单倍体原核,之间由微管相连接,负责两个单倍体原核的迁移靠近.与体外受精相比较,孤雌活化时卵母细胞更容易被激活,减数分裂期间微管的发育早且更完善.     

微齿喜马拉雅低额溞的生殖与发育

对微齿喜马拉雅低额溞（Ｓｉｍｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｈｉｍａｌａｙｅｎｓｉｓ　ｍｉｏｒｏｄｕｓ）的生殖和发育进行研究的结果表明：在２０±１℃换水条件下，喂以斜生栅藻（４０万个／ｍｌ），此　有４个幼龄、１６个成龄，平均寿命４８．７±８．９２天。平均总产仔量３６１．ｌ±２１．５个，最大生殖量在第１０龄（第６成龄）。已经证明从冬卵（受精卵）来的孤雌生殖溞在体长和产仔量上都高于其来自孤雌卵的下代孤雌　。两性生殖与降低温度有关，发生在秋季生殖高峰期水温已下降时，与食物的多少无直接关系。本种在自然界属于单周期型，它的交配行为特殊与其仰游习性相适应。文章对冬孵和孤雌卵的发育做了描述。     

化学联合激活可明显提高小鼠孤雌胚胎发育率

为探讨一种高效的小鼠卵母细胞孤雌激活的方案,进一步提高孤雌囊胚发育率。用不同浓度的氯化锶及不同作用时间的乙醇,并分别联合6-DMAP对不同卵龄小鼠卵母细胞进行活化,统计小鼠卵母细胞卵裂率和体外发育状况。结果显示,15～16h、18～19h和20～21h卵龄组卵母细胞经6mmol/LSrCl2联合6-DMAP处理后,三组的激活率随卵龄增长而升高,其中20～21h卵龄组显著高于15～16h、18～19h组(P<0.05),激活胚胎的发育率以18～19h时最高;6mmol/L和10mmol/L的SrCl2联合6-DMAP均能有效地激活小鼠卵母细胞,激活率分别为76.4%和83.6%,桑葚胚率分别为50.0%和56.3%;70ml/L乙醇联合6-DMAP以处理7min组获得了较好的激活率和囊胚发育率,分别为77.1%和42.4%,囊胚率均显著高于4min和10min处理组(P<0.05)。6-DMAP与SrCl2或乙醇联合应用可以有效抑制第二极体的排出,提高激活胚的二倍体比率;孤雌囊胚的平均细胞数显著低于正常受精囊胚(P<0.05)。不同激活方案对孤雌活化胚的核型和发育能力的作用差异较大,小鼠卵母细胞孤雌激活率与卵龄...     

大鼠卵母细胞体外发育过程中的微管组装研究(英)

大鼠卵母细胞的发育具有许多与其他哺乳动物不同的特点,用激光共聚焦显微术研究了大鼠卵母细胞发育过程中微管的组装过程,以及一些因素对微管组装过程的影响.结果表明,在大鼠卵母细胞减数分裂的细胞周期进程中,细胞微管系统发生广泛而剧烈的重组,紫杉醇、星形孢菌素和冈田酸等药物能显著改变卵母细胞内的微管组织状态.大鼠卵母细胞可以在体外发生自发的孤雌活化,也可以被细胞松弛素诱导发生胞质假分裂.因此,研究了在这些过程中微管结构的特殊构象,以期更加深入认识这些特殊细胞事件的生化机理.     

大鼠卵母细胞体外发育过程中的微管组装研究

大鼠卵母细胞的发育具有许多与其他哺乳动物不同的特点,用激光共聚焦显微术研究了大鼠卵母细胞发育过程中微管的组装过程,以及一些因素对微管组装过程的影响.结果表明,在大鼠卵母细胞减数分裂的细胞周期进程中,细胞微管系统发生广泛而剧烈的重组,紫杉醇、星形孢菌素和冈田酸等药物能显著改变卵母细胞内的微管组织状态.大鼠卵母细胞可以在体外发生自发的孤雌活化,也可以被细胞松弛素诱导发生胞质假分裂.因此,研究了在这些过程中微管结构的特殊构象,以期更加深入认识这些特殊细胞事件的生化机理.     

Oct4基因在猪孤雌激活和体外受精早期胚胎中的表达特征

目的研究植入前胚胎发育重要基因Oct4在猪孤雌和体外受精胚胎中的表达特征。方法收集成熟卵母细胞、孤雌和体外受精2细胞、4细胞、8细胞胚胎和囊胚,做荧光即时定量PCR检测,以体外成熟的猪卵母细胞做对照分析相对表达量。结果孤雌组和体外受精组胚胎在8细胞期Oct4表达量均最高(P<0.05),在孤雌和体外受精组囊胚相对于其他时期Oct4表达量最低(P<0.05)。在同一时期孤雌和体外受精胚胎上Oct4表达并没有差异。结论多能性基因Oct4在卵裂发育时期表达量动态变化,孤雌胚胎在一定程度上可作为体外胚胎基因表达的模型,且不同的胚胎培养条件可能导致基因表达的差异。     

科学家首次获得灵长类孤雌干细胞

孤雌生殖是一个非常特异的现象 ,卵子在没有雄性配子作用的情况下 ,经外在因素的刺激激活后 ,可以正常发育 ,在低等动物如两栖类可以产生正常后代个体 .在有些高等动物 ,孤雌激活的卵子可以发育到囊胚阶段 ,但不能发育成后代个体。最近美国科学家 (ＣｉｂｅｌｌｉＪＢ等 )在研究中发现 ,孤雌刺激 (钙离子浓度增加结合蛋白质合成和蛋白质磷酸化抑制剂处理 )猴子 (Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ)卵细胞 ,部分卵细胞 (4/2 8,14% )激活后发育到囊胚阶段。取囊胚内团细胞 ,得到了一个稳定细胞系 (Ｃｙｎｏ 1)。经体外培养诱导 ,该细胞系…     

猪无透明带卵母细胞孤雌激活培养体系的优化

为了探讨猪无透明带卵母细胞孤雌激活培养体系,为手工克隆法生产小猪奠定理论和实验基础,本研究比较了不同浓度链霉蛋白酶对猪卵母细胞透明带的消化率及后期发育的卵裂率;比较了不同电激活参数对无透明带卵母细胞激活效率的影响,并探索了最适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小。结果表明:2 mg/m L链霉蛋白酶能得到最高的消化率及后期发育的卵裂率;最佳电激活参数为:70 V/mm电压,80滋s脉冲时间,2次脉冲;较适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小为:底部直径约为l20μm,深度约为150μm。     

电刺激家兔卵母细胞孤雌活化的研究

采用电刺激使家兔卵母细胞孤雌活化,并对电刺激参数和电刺激介质进行选择,发现在电刺激电压为1.5kV/cm,脉冲持续时间为80us,电刺激3次,电刺激介质为M16的条件下,兔卵母细胞孤雌活化效果最好,可使95％的兔卵母细胞激活,体外培养有89.5％的激活卵发育到正常的8—16细胞期,12％的激活卵发育到囊胚,在体内培养的条件下,26％的激活卵发育到囊胚。采用不同的电刺激介质,卵母细胞最佳激活条件和发育情况不同,表明电刺激介质中Ca~(++)和Mg~(++)浓度似乎与卵母细胞的孤雌活化和维持早期发育有关。家兔在注射LH后17—19小时取卵,电刺激效果最好,激活卵在含细胞松弛素B的培养基中培养3小时,电镜观察已有原核形成,细胞膜附近的细胞器向中央移动。光镜检查表明:约有85％的激活卵具有二个原核,约15％的激活卵有四个原核。     

乙醇及6-DMAP对小鼠卵母细胞孤雌激活的研究

实验研究了乙醇、6-DMAP以及二者联合使用时对注射hCG后18小时采集的小鼠卵母细胞孤雌激活的效果。结果证明:(1)用5％的乙醇分别作用5和10分钟及10％的乙醇分别作用5和10分钟,小鼠卵母细胞的孤雌激活率分别为41.3％、63.7％、57.9％和85.6％。说明在一定范围内,随着乙醇浓度和作用时间的增加,小鼠卵母细胞孤雌激活率有上升的趋势。(2)用2mM 6-DMAP作用2、4和6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率分别为 12.0％、25.0％和40.0％。说明随着6-DMAP作用时间的增加,小鼠卵母细胞的孤雌激活率有所升高。(3)用5％乙醇作用5分钟,再用含有2mmol/L 6-DMAP的培养液培养6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率可达65.5％,明显高于单独使用5％乙醇作用5分钟或单独使用2mmol/L 6-DMAP作用6小时卵母细胞的孤雌激活率。(4)用10％的乙醇作用5分钟,再用含有2mmol/L 6-DMAP的培养液培养6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率达到100％,远远高于单独使用10％乙醇作用5分钟或单独使用2mmol/L 6-DMAP作用6小时卵母细胞的孤雌激活率。(5)在单独使用乙醇刺激时,激活卵母细胞中直接卵裂(2-细胞)的比率随乙醇作用强度的增加而增加,最高达62.5％;但6-DMAP则抑制激活卵母细胞的直接卵裂,增加二原核卵的比例。     

爬竹胚胎学研究

爬竹胚胎学研究庞延军,胡成华,喻富根（南京大学生物科学与技术系,南京２１００９３）本文初步报道了爬竹（Ｄｒｅｐａｎｏｓｔａｃｈｙｕｍｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）大小孢子发生,雌、雄配子体发育,胚及胚乳和果实发育,其观察结果如下：１．幼嫩花药的药壁由表皮...     

小鼠孤雌激活来源囊胚线粒体基因表达

为了探索孤雌胚胎和正常体外受精胚胎线粒体基因表达的差异,本研究用ICR小鼠孤雌和正常受精胚胎为研究对象。孤雌和正常受精的胚胎分别发育至2-细胞期和囊胚期的比率,用q PCR方法检测囊胚线粒体基因Cox2、tom40、tim23和cytochrome C,以及多能性囊胚质量相关基因Oct4、Sox2和nanog的表达水平。结果发现孤雌激活不影响小鼠卵母细胞的卵裂(95%vs 97.6%,p0.05),但影响胚胎发育到囊胚(39.4%vs 75%,p0.05),孤雌囊胚细胞线粒体Cyto C和Cox2显著高于体外受精组(p0.05);正常受精囊胚多能性基因Oct4和nanog表达水平显著高于孤雌组(p0.05),但Sox2表达水平显著低于孤雌组(p0.05)。本研究表明孤雌激活可影响胚胎线粒体和细胞基因表达水平。     

隆线溞孤雌溞生殖系统的组织学

隆线孤雌的生殖系统由一对卵巢、一对输卵管和一对雌性生殖孔组成。卵巢长管状 ,管壁由结缔组织膜和单层上皮细胞构成 ,末端渐细为一短小的输卵管 ,输卵管末端为雌性生殖孔。卵子的发生是由生发区细胞向卵巢内增殖分化 ,不同成熟度的生殖细胞在管腔内排列成生殖带。根据卵母细胞细胞核的大小及卵黄的累积情况等 ,将卵子的发生划分为三个时期 :卵原细胞、卵母细胞和成熟卵子 ,其中卵母细胞的发生又可细分为三个时期 :前期、中期和后期。后期的卵母细胞含较多的卵黄颗粒 ,最后成为成熟卵子 ,排入孵育囊内形成夏卵。隆线孤雌的卵巢发育要经历五个幼龄期 ,不同的龄期 ,卵巢的形态结构不同。至第五幼龄 ,卵巢已基本发育成熟 ,准备排卵进入第一成龄     

化学激活和季节对克隆猪出生率的影响

为了解化学激活对克隆猪出生效率的影响, 研究了体外成熟的猪卵母细胞被激活恢复减数分裂到克隆猪出生的整个过程. 首先研究了电激活(Ele), Ele+CHX+CB和Ele+6-DMAP 3种激活方法对猪卵母细胞孤雌激活(parthenogenetic, PA)和核移植(nuclear transfer, NT)重构胚体外发育的影响. 比较了Ele或Ele+CHX+CB激活方法对克隆猪出生效率的影响. 实验中单独列出了PA胚的扩张囊胚率或NT优质囊胚率来代表囊胚的质量. 结果表明: 化学联合激活提高了PA的囊胚率和扩张囊胚率, 但对PA胚的卵裂率和囊胚细胞数没有显著影响(P>0.05). Ele+6-DMAP对PA胚的囊胚率和扩张囊胚率有显著提高(P<0.05), 但对NT胚的囊胚率和优质囊胚率没有提高甚至降低了NT胚的发育. Ele+CHX+CB虽然提高了NT胚的囊胚率(P<0.05), 但对优质囊胚率没有影响. Ele+CHX+CB激活方法使克隆猪出生率有所提高但不显著. 本文还研究了季节对猪孤雌发育和克隆猪出生率的影响. 结果表明, 春季收集的猪卵母细胞使用3种激活方法卵母细胞的孤雌囊胚率均高于冬季收集的猪卵母细胞的囊胚率. 春季和冬季进行移植, 克隆猪出生率没有区别. 综上, 在PA中获得的结果与NT胚中获得的结果不一定完全匹配, 说明孤雌激活和重构胚的激活机制还是有区别的. 化学联合激活虽然能提高囊胚率, 但它的作用相当于降低囊胚形成的门槛, 却不是从本质上改变囊胚发育能力, 因此不能显著提高克隆猪出生效率. 春季收集的卵母细胞在体外培养中的发育能力好于冬季收集的卵母细胞, 但季节对克隆猪出生率没有显著影响.     

高尔基体对小鼠卵母细胞体外发育进程的影响

目的初步探讨高尔基体在小鼠卵母细胞体外发育进程中的作用。方法布雷菲德菌素A（Brefeldin A,BFA）处理小鼠未成熟,成熟卵母细胞,利用特异性标记物阻COP标记高尔基体。激光扫描共聚焦显微镜观察BFA处理对高尔基体产生的影响;同时。观察并比较不同处理组小鼠未成熟／成熟卵母细胞的体外成熟率、孤雌激活率、体外受精率及2-细胞率。结果GV期卵母细胞经BFA处理后,高尔基体的形态和分布发生明显改变。其体外成熟率（2．5％）与对照组（70．4％）比较统计学差异显著（P〈0．001）;洗掉BFA后,其体外成熟率（67．2％）与对照组无统计学差异（P〉0．05）。另外,成熟卵母细胞经BFA处理后。其体外受精率及2．细胞率均与对照组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论小鼠卵母细胞体外成熟的正常进行需要高尔基体主导的膜运输。而体外受精和受精卵卵裂过程中不需要功能性的高尔基体。