苜蓿红豆草属间体细胞杂种的分子生物学鉴定

通过原生质体融合和培养获得苜蓿红豆草属间体细胞杂种植株。采用一种简便方法从杂种组织再生植株叶片、红豆草羟脯氨酸抗性系再生植株叶片和苜蓿根癌农杆菌702转化系愈伤组织提取DNA用于RAPD和Southern杂交分析。随机引物扩增结果显示两种亲本的RAPD多态具有明显差异。在所用20种随机引物中,6种产生较多的DNA片段。杂种组织具有两种亲本特有的DNA片段,但倾向于排除红豆草亲本的染色体,表明该杂种为非对称杂种,两种亲本染色体之间可能发生了重组。由于红豆草DNA的介入,杂种组织表现出较强的分化能力。分别利用RAPD扩增得到的OPA141000bp红豆草羟脯氨酸抗性系特异产物和OPA141600bp苜蓿根癌农杆菌702转化系特异产物为探针进行Southern分子杂交,证明杂种组织同时具有这两种DNA片段的同源序列。     

小麦与禾草对称融合中杂种染色体组成与亲缘关系的初步探究

采用PEG 法诱导普通小麦的原生质体与新麦草、无芒雀麦及韦氏雀麦等3 种近缘或远缘属间禾草的原生质体进行对称融合。对融合再生细胞系进行形态比较、同工酶分析及5S rDNA间隔序列差异分析, 以鉴定其杂种性质。对部分杂种细胞系进行了染色体组成的分析, 就体细胞杂种中小染色体及染色体断片的产生与异源核质的互作及亲缘远近的关系等问题进行了讨论。     

小麦与高冰草不对称体细胞杂种F_5代部分株系的根尖细胞染色体分析

将普通小麦“济南177”(Triticum oestivum cv．Jinan 177)原生质体(受体)和经紫外线照射的高冰草Agropyron elongatum)原生质体(供体)用PEG(聚乙二醇,polyethylene glycol)法诱导融合,获得外形偏向小麦的不对称体细胞杂种及后代。经过田间繁育,现已到F5代。对来源于同一个体细胞杂种克隆的不同株系(Ⅱ-2,8-l,Ⅱ-I-8)的F5代的根尖细胞染色体进行核型分析,并与其亲本比较,结果表明,杂种株系染色体的形态、数目在遗传上均趋于稳定。各杂种株系的染色体与亲本小麦“济南177”之间有多处显著的不同,杂种株系之间也存在差异,推测高冰草的染色体小片段可能进入了受体小麦的染色体中。     

消除聚乙二醇的毒性

在制备体细胞杂种过程中,常用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合。但是,使用这种化学试剂常常使融合细胞的活性较低。融合细胞活性的损失以及相应的体细胞杂种产生效率的降低一直被认为是由于PEG的毒性所造成的,而最近加拿大的研究人员高国楠和M.Saleem报告说,PEG本身对原生质体是无毒的。高和Saleem在对苜蓿(Medicago sativa)和光烟草(Nicotiana glauca)的叶肉原生质体以及大豆子叶原生质体所做的研究中发现,用一种混合床离子交换树脂脱去PEG中的     

花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定

利用非对称体细胞杂交技术,获得芸薹属花椰菜（Brassica oleracea var．botrytis）与黑芥（B．nigra）的种间杂种,实现了野生种质抗病基因向甘蓝类蔬菜作物的渗透。以具有良好再生能力的花椰菜下胚轴原生质体作为融合受体,具有抗黑腐、黑胫和根肿病优良性状的黑芥叶肉原生质体作为融合供体,用不同强度的UV射线处理后,利用PEG方法诱导供、受体原生质体融合。培养后获得170棵再生植株。选取来自40个不同愈伤组织的40棵单株进行形态学观察及RAPD和SRAP分子标记检测,结果表明其中30棵为体细胞杂种。染色体计数显示,约23％杂种植株的染色体数目小于供、受体染色体数之和。用流式细胞仪测定DNA含量显示,杂种植株DNA含量是受体的2—4倍,20％杂种植株DNA含量小于供、受体之和。     

花椰菜与黑芥种间体细胞杂种的获得和鉴定

利用非对称体细胞杂交技术, 获得芸薹属花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)与黑芥(B. nigra)的种间杂种, 实现了野生种质抗病基因向甘蓝类蔬菜作物的渗透。以具有良好再生能力的花椰菜下胚轴原生质体作为融合受体, 具有抗黑腐、黑胫和根肿病优良性状的黑芥叶肉原生质体作为融合供体, 用不同强度的UV射线处理后, 利用PEG方法诱导供、受体原生质体融合。培养后获得170棵再生植株, 选取来自40个不同愈伤组织的40棵单株进行形态学观察及RAPD和SRAP分子标记检测, 结果表明其中30棵为体细胞杂种。染色体计数显示, 约23%杂种植株的染色体数目小于供、受体染色体数之和。用流式细胞仪测定DNA含量显示, 杂种植株DNA含量是受体的2-4倍, 20%杂种植株DNA含量小于供、受体之和。     

电融合获得用于选择抗CTV砧木的酸橙与甜橙体细胞杂种植株

在已知参数条件下,通过电场诱导酸橙(Citrus aurantium L.)叶肉原生质体和沙漠蒂甜橙(C.sinensis Osbeck cv.Shamouti)的胚性愈伤组织原生质体融合,融合产物经培养再生出40棵植株.染色体检查表明所得到的植株具有36条染色体,为四倍体植株.再生植株具有翼叶,叶片厚,表现出多倍体的特征.采用2个10-碱基随机引物鉴别再生植株的杂种特性.在2个引物的扩增带型中,再生植株的随机扩增带图里出现了融合亲本的特征带.对再生植株染色体计数和RAPD分析的结果表明它们是酸橙和甜橙种间异源四倍体体细胞杂种植株.这些体细胞杂种植株的获得为选择具有酸橙优良性状、同时抗CTV的新型砧木提供了好的试材.     

普通小麦与玉米不对称体细胞杂交的研究

以长期继代培养,经分化实验证明无分化能力的普通小麦（Triticum aestivum L.)济南177原生质体为受体,以经380uW/cm^2紫外线处理的继代第3－5天的墨西哥黑甜玉米（Zea mays L.cv.Sccharina F.Nigera)胚性悬浮组织原生质体为供体,使用PEG的方法诱导融合。融合再生的18个单细胞克隆的愈伤组织经形态学比较、染色体检查、同工酶分析、5S rRNA间隔序列分析,确认克隆1为杂种愈伤组织,杂种愈伤组织再生出来的白化苗未进行杂种鉴定。同时,初步探讨了紫外线对玉米原生质体的影响。     

甘薯同一不亲和群内品种间体细胞杂种

利用PEG融合方法,融合甘薯(Ipomoea batatas)B不亲和群内品种‘koganesengan'和‘bitambi'的原生质体.将融合处理的原生质体进行培养,共获得45株再生植株.4株再生植株形态上表现出融合双亲的中间特性,其中2株染色体数为融合两亲之和(2n=12x(2n 2n)=180),另外2株分别为41～103和35～100,因细胞不同而不同.经RAPD分析,这4株再生植株分别具有双亲特异的DNA扩增带或双亲都不具有的新扩增带.鉴定这4株再生植株为杂交不亲和的B群内品种间体细胞杂种.     

小麦与禾草对称融合中杂种染色体组成与亲缘关系的初步探究

采用ＰＥＧ法诱导普能小麦的原生质体与新麦草、无芒雀麦及韦氏雀麦３种近缘或缘间禾草的原生质体进行对称融合。对融合再生细胞系进行形态比较、同工酶分析及５SrDNA间隔序列差异分析,以鉴定其杂种性质。对部分杂种细胞系进行了染色体组成的分析。就体细胞杂种中小染色体及染色体断片的产生与异源核质的互作及亲缘远近的关系等问题进行了讨论。     

小麦与高冰草体细胞杂种F2代的性状和蛋白质组分

普通小麦（Triticum aestvum L.）“济南177”原生质体和经紫外线照射的高冰草（Agropyton elongatum(Host)Nevski）原生质体（供体）用PEG法诱导融合,形成外形偏像小麦的不对称体细胞杂种植株及后代,F2代株系可分为3种类型：1.株型松散、大穗大粒;2.株型直立紧凑、分蘖多、中穗型;3.大穗大粒直立型。蛋白质含量明显优于亲本小麦,株系之间也存在显差异;采用微IEF／SDS－PAGE双向电泳技术分析杂种F2代植株旗叶及幼胚蛋白质组分可见,杂种不仅含有双亲的蛋白质组,而且还产生了特异的新蛋白;不同杂种株系间蛋白质组分差异明显。     

普通小麦与簇毛麦对称及不对称体细胞杂交的比较

由长期继代的小麦品种济南177悬浮系制备原生质体为受体,取继代一年的簇毛麦愈伤组织不经照射或经⁶⁰Co-g射线照射,剂量分别为40,60,80Gy(1.3Gy/min),然后分离原生质体为供体,在PEG诱导下分别进行了对称及不对称融合(g融合).经形态学、细胞学、同工酶及5SrDNA间隔序列分析鉴定,对称及不对称融合均高频率地获得了体细胞杂种细胞系,并在对称融合及低剂量g辐照组合得到再生杂种植株.基因组原位杂交的结果证实,对称及不对称融合杂种中异源染色体间不同方式的易位及重组均普遍存在.g辐照存在剂量效应.结果表明:对称及不对称体细胞杂交均可有效地实现核基因的转移与重组,而不对称体细胞杂交还可直接导致染色体小片段易位,显示出此方法在小麦育种上的独特优势.     

胡萝卜与川西獐牙菜不对称体细胞杂种的核/质基因组特征

胡萝卜(Daucus carota var.sativa)原生质体与经260μW/cm2紫外线照射的川西獐牙菜(Swertia mussotii)原生质体用PEG法诱导融合.对融合再生的克隆的5SrDNA间隔序列和RAPD分析结果得知,各再生克隆均存在双亲的核DNA及重组DNA.杂种的核基因组组成以胡萝卜(受体)为主,供体川西獐牙菜DNA谱带较少;UV照射剂量对体细胞杂种核基因组组成没有明显的影响.进一步对再生克隆叶绿体DNA的SSR分析表明,杂种细胞中双亲叶绿体基因组随机分离并发生重组.     

普通小麦与无芒雀麦不对称体细胞杂交的研究

普通小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）９９Ｐ原生质体与经紫外线照射的无芒雀麦（ＢｒｏｍｕｓｉｎｅｒｍｉｓＬｅｙｓ）愈伤组织来源的原生质体用ＰＥＧ法诱导融合。融合再生的３个单细胞克隆（Ｎｏ．１～Ｎｏ．３）经染色体、同工酶和ＲＡＰＤ分析表明,它们均为杂种细胞系。Ｎｏ．１克隆形成的愈伤组织分化出大量白化苗,其叶片同工酶和ＲＡＰＤ分析均出现双亲特征谱带及新带,白化苗的染色体数目为４２～５４,大于亲本小麦,并具有无芒雀麦的小染色体和染色体断片,确认它们为不对称体细胞杂种。     

小麦与高冰草属间体细胞杂交获可育杂种植株

普通小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．２ｎ＝４２）“济南１７７”与紫外线照射的高冰草（长穗偃麦草Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｅｌｏｎｇａｔｕｍ,２ｎ＝７０）原生质体在ＰＥＧ诱导下融合,获杂种再生植株。取杂种子房诱导产生愈伤组织并再生植株,经染色体和同工酶鉴定,它们仍保留杂种性质。其中两株移栽成活并结实,杂种性质也经表型、染色体、同工酶和ＲＡＰＤ分析得到证明。在Ｆ０和Ｆ１代植株根尖细胞中,均发现高频率地存在着染色体断片;从Ｆ２代花粉母细胞减数分裂的染色体数目及行为发现,杂种细胞染色体数目主要分布在１８Ⅱ～２２Ⅱ,染色体断片发生配对及分离,表明它们是小染色体（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）。Ｆ１及Ｆ２代植株比亲本小麦（“济南１７７”）秆茎粗硬、生长健壮,穗大粒大,已经产生具有优良性状的Ｆ２代穗系     

电融合获得用于选择抗CTV砧木的酸橙与甜橙体细胞杂种植株

在已知参数条件下,通过电场诱导酸橙（Cit-rus aurantium L.）叶肉原生质体和沙漠蒂甜橙（C.sinensis Osbeck cv.Shamouti）的胚性愈伤组织原生质体融合,副合产物经培养再生出40棵植株。染色体检查表明所得到的植株具有36条染色体。为四倍体植株。再生植株具有翼叶,叶片厚,表现出多倍体的特征,采用2个10－碱基随机引物鉴别再生植株的杂种特性。在2个引物的扩增带型中,再生植株的随机扩增带图里出现了融合亲本的特征带。对再生植株染色体计数和RAPD分析的结果表明它们是酸橙和甜橙种间异源四倍体体细胞杂种植株。这些体细胞杂种植株的获得为选择具有酸橙优良性状、同时抗CTV的新型砧木提供了好的试材。     

庆丰链霉菌原生质体的形成、再生及融合重组的研究

庆丰链霉菌生长在不含甘氨酸的培养基中,其细胞壁能很好地被溶菌酶溶解,释放出原生质体。原生质体不仅可以在R_2、RM和RG培养基上再生,而且在高渗庆丰链霉菌斜面孢子培养基上也能再生,孢子也比较丰满。A54菌株的再生频率是30.5％,A201菌株为38％。原生质体在4℃贮存过夜,再生频率降低30％以上。PEG能有效地诱导庆丰链霉菌原生质体融合重组,不同分子量的PEG诱导效果不一样,PEG1000的效果最好,重组频率可达10~(-2),和常规杂交相比,重组频率可以提高10—1000倍。用PEG诱导原生质体融合重组时,性因子的存在与否对重组频率没有明显的影响。     

小麦与谷子不对称体细胞杂交

以不同剂量的紫外线(UV)照射谷子(Setariaitalica cy. Shanxi)原生质体为供体与普通小麦(Triticum aestivum)济南177和99P的原生质体用PEG法诱导融合.利用同工酶,RAPD和染色体分析再生的克隆及白化苗.从小麦济南177与谷子融合再生的86个克隆中,24个被鉴定为杂种克隆;而小麦99P与谷子融合再生的67个克隆中,27个被鉴定为杂种克隆.虽然用作融合材料的双亲培养细胞均丧失再生能力,但是部分来源于低剂量UV处理的杂种克隆再生了绿点、根和白化苗.证明小麦体细胞杂交中的双亲再生能力互补现象也存在于远缘族间融合组合中.讨论了小麦远缘族间融合未能再生绿色植株的原因.     

混合小麦亲本与新麦草不对称体细胞杂交体系的建立

以小麦品种济南177悬浮细胞系来源的原生质体与同品系胚性愈伤组织制备的原生质体混合后作为受体;以经过380μＷ/ｃｍ²紫外线照射1min、2min的新麦草原生质体分别作为供体,用PEG法诱导融合。组合Ⅰ(176+cha9+新麦草UV 1min)获得16个再生克隆。经过形态学、同工酶、染色体和RAPD分析,确定其全部为属间体细胞杂种。其中的5个克隆再生杂种植株。用7对小麦SSR引物对杂种克隆的叶绿体基因组进行了分析;组合Ⅱ(176+cha9+新麦草UV 2min)只获得3个克隆,且逐渐褐化死亡。表明以小麦济南177的两种培养细胞混合作受体的融合体系有利于杂种的获得及再生;紫外线对融合产物的生长发育有明显的剂量效应。     

从胡萝卜与芹菜原生质体融合获得细胞杂种

试验以胡萝卜根和芹菜叶肉原生质体为亲本,用PEG高pH,高Ca~( )法诱导融合。异源融合率最高可达8％,一般在3％～5％之间。从150余棵融合再生植株中,经形态、同工酶谱、叶片中内含芳香物质等指标测试,鉴定出三棵(No 1,2,8)融合再生植株为芹莱和胡萝卜的细胞杂种。