染色体外同源重组结合细胞质注射途径研制转基因小鼠

以绵羊β-乳球蛋白基因(B—Lactoglobulin,β-LG)为转基因表达框架,将人G-CSF,(Human Granulocyte Colony Stimulating Factor,4G-CSF)基因与报告基因一增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescenct Protein,EGFP)基因作为双表达单元拼接到口β-LG基因的第一外显子处,并在G-GSF基因两侧引入同源重组位点loxP、fox2272,将打靶基因表达构件β-LG-hG-GSF-IRES-EGFP(总长9．3kb)分为两段进行构建,片段Ⅰ(长5．9kb)与片段Ⅱ(长5．6kb)两段重叠部分为2．2kb。向小鼠受精卵细胞质共注射构件片段Ⅰ、Ⅱ和NLS(核定位信号)3个基因片段。对仔鼠进行整合与表达的检测。PCR-Southem杂交检测结果表明,片段I的整合率为62．3％(86／138),片段Ⅱ的整合率为54．3％(75／138),片段Ⅰ、Ⅱ共整合(包括两片段分别整合和染色体外同源重组两种情况)的小鼠为62只,整合率为44．9％(62／138),其中在双阳性转基因小鼠中发生染色体外同源重组的几率为80．6％(50／62)。RT-PCR-Southem检测了10只发生染色体外同源重组的转基因雌性小鼠,hG-GSF基因的表达率为90％(9／10),EGFP基因的表达率为100％(10／10),通过对其乳汁紫外吸收光谱的检测,EGFP基因的表达率为50％(5／10)。上述结果表明,染色体外同源重组结合细胞质注射技术研制转基因动物是简便实用的转基因途径。     

利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除

目的:探索通过细菌人工染色体(BAC)同源重组系统构建条件基因敲除载体的高效率方法,提高条件基因敲除小鼠(Flox小鼠)的构建效率。方法:利用作者自己构建的噬菌体重组酶系统,通过BAC同源重组进行条件型基因敲除载体构建工作。首先通过亚克隆构建了一系列载体含有同源臂的靶向质粒,线性化后,打靶片段经电穿孔法转入大肠杆菌内,与相应的BAC同源重组,再经过三步同源重组和一步位点特异性重组,构建小鼠条件型基因敲除载体。结果:高效率构建了小鼠基因的最终条件基因敲除载体。结论:通过BAC同源重组高效构建条件基因敲除载体,为条件基因敲除载体的构建提供了全新思路,并为FLox小鼠的建立,及相应基因在发育、生理、致病机制等方面的功能研究奠定了基础。     

转基因小鼠乳腺表达人胰岛素基因的研究

转基因动物乳腺生物反应器表达和生产医用蛋白是国际上的研究热点,目前已有很多成功的转基因动物乳腺表达出外源蛋白质［１］。在转基因动物乳腺表达的蛋白质包括凝血因子Ⅸ、组织纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）、α１抗胰蛋白酶原、白介素２、蛋白质Ｃ、超氧化物歧化酶...     

胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性基因剔除研究的重要工具。为了建立胰腺组织特异性Cre转基因小鼠,我们通过PCR克隆了大鼠胰岛素基因启动子,并用它指导Cre基因在胰岛细胞中的特异性表达。在Cre重组酶基因5′端添加了真核核糖体结合序列和核定位序列以使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核中发挥功能;同时,在Cre基因3′端添加了含内含子的3′端人生长激素基因。表达载体经显微注射导入小鼠受精卵以建立转基因小鼠。PCR检测显示共获得7只Cre整合阳性的转基因首建者小鼠;RTPCR结果表明其中1只首建者小鼠的子代鼠在胰腺中转录了外源基因,进一步的Southern杂交结果表明,该转基因小鼠能够在胰腺中表达有功能的Cre重组酶。      

利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除

利用EL350基因工程菌进行同源重组, 成功进行基因敲除已有报道, 但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛b 酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体, 设计不同的同源臂, 成功地敲除了b 酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列, 插入新的基因, 研究其表达功能, 或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

利用同源重组提高外源GUS基因在植物组织中表达

将１８Ｓ ｒＲＮＡ基因的部分片段,或烟草的核骨架结合序列（ＳＡＲｓ）作为同源序列与外源ＧＵＳ基因作为报告基因构建成用于基因打靶载体,以枪或农杆菌介导转化到拟南芥的根组织中,检测ＧＵＳ基因瞬间表达的结果显示,两种同源基因序列均可提外源ＧＵＳ基因的表达。     

肥大软骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

肥大软骨细胞是软骨细胞的终末分化形式,在软骨内成骨过程中发挥十分关键的作用。为了研究肥大软骨细胞在骨骼发育过程中的功能,我们构建了在8.2 kb小鼠X型胶原基因（Col10a1）启动子控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠品系（Col10a1-8.2-Cre）。采用显微注射法将11.5 kb的转基因片段引入小鼠基因组,共注射受精卵328枚,获得子代鼠51只,经PCR基因型鉴定有3只在基因组上整合有Cre重组酶基因。PCR检测发现Col10a1-8.2-Cre转基因在含有肥大软骨细胞的组织中表达。为了检测Cre重组酶表达的强度和组织特异性,转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配。子代ROSA26;Col10a1-8.2-Cre双转基因小鼠LacZ染色检测的结果显示,Cre重组酶在所有的肥大软骨细胞中表达。原位杂交的结果验证Col10a1-8.2-Cre转基因表达在肥大区的上端。以上结果表明,我们建立的肥大软骨细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠品系可以作为一种遗传学工具,介导目的基因在肥大软骨细胞中的敲除。     

Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性条件敲除研究的关键。采用PCR扩增大鼠胰岛素基因705bp启动子指导发胰岛细胞中特异表达;同时采用改构的Cre重组酶基因,在其5'端添加有真核核糖体结合序列和核定位序列使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核能发挥功能;同时,为了保证原核基因Cre能在真核系统顺利表达,在其3'端添加含内含子的人生长激素基因。构建的表达载体在去除原核序列后用显微注射方法转基因小鼠,在出生的27只仔鼠中,PCR检测共获得7只Cre整合阳性的转基因小鼠,整合率26％。这种Cre转基因小鼠与基因组小携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配,在胰腺组织中可以检测到Cre介导的重组,表明Cre在转基因小鼠胰腺中有表达。     

特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的方法

利用组织特异性分子标志物启动子调控Cre重组酶,研制了6种在不同组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠.这些转基因小鼠的基因型鉴定均使用设计在Cre基因编码区的通用引物.为了特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶的转基因小鼠,在大鼠胰岛素RIP启动子上和Cre基因上设计1对引物进行PCR扩增,并通过凝胶电泳进行分析.PCR结果显示,设计在Cre基因上的通用引物可以从6种不同组织特异性Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增获得480 bp产物;利用本研究设计的特异性引物可以从胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增200 bp的目的条带.这一结果表明,利用特异性引物进行PCR反应,可有效地将胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠与其他多种组织的Cm重组酶转基因小鼠鉴别开来.     

干扰素诱导Mx—Cre转基因小鼠表达的重组酶活性的体外检测

利用PCR、Western blot、免疫组化、免疫金标电镜、Southern blot从DNA水平,蛋白水平分析干扰素诱导后Mx-Cre转基因小鼠肝组织中Cre重组酶的表达及其表达产物的活性,在对Mx-Cre转基因小鼠基因组中整合有cre基因进行确定后,通过干扰素诱导Mx-Cre转基因小鼠表达Cre重组酶,结果表明转基因小鼠肝细胞核和细胞质中均有Cre重组酶的表达,并在超微水平进一步证实,将含表达的Cre重组酶的肝细胞核抽提液加入到带有loxP位点的DNA中进行重组,分析证明Mx-Cre转基因小鼠表达的Cre重组酶具有重组活性,从而建立了体外检测Mx-Cre转基因re重组酶活性的方法。     

血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

血管内皮细胞参与血管形成、血管稳态维持、血栓形成、炎症和血管重建等生理和病理过程。为了便于通过Cre-LoxP系统研究相关基因在血管内皮细胞中的功能,创建了Tie2-Cre转基因小鼠,利用Tie2基因的启动子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细胞中表达。经基因组PCR和Southern Blot鉴定有6只小鼠在基因组上整合有Cre基因,整合率为11％。为了验证Cre重组酶的剪切活性和表达组织分布,我们将Tie2-Cre转基因小鼠分别与Smad4条件基因打靶小鼠和报告小鼠ROSA26交配。Tie2-Cre;Smad4^co/＋小鼠的多个组织的基因组DNA的PCR结果显示,Cre重组酶在所有包含血管内皮细胞的组织中表达并能介导LoxP间的重组。Tie2-Cre;ROSA26双转基因胚胎LacZ染色结果显示,Cre重组酶在所有被检测组织的血管内皮细胞中特异性表达。因此．Tie2-Cre转基因小鼠可作血管内皮细胞谱系分析和在血管内皮细胞进行条件基因打靶的理想工具小鼠。     

平滑肌细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠Cre重组酶的表达分布

利用转基因技术构建了平滑肌细胞特异表达Cre重组酶的转基因小鼠（SMA-Cre）,将该小鼠与基因组上携带LoxP位点的ROSA26小鼠杂交,通过LacZ染色检测Cre重组酶介导重组的功能以及表达的组织特异性。结果显示,在气管C形软骨连接处平滑肌、细支气管壁平滑肌、食道壁平滑肌、胃壁平滑肌、小肠壁平滑肌、子宫壁平滑肌、膀胱壁平滑肌、血管壁平滑肌、心肌及骨骼肌中检测到Cre重组酶活性。表明SMA—Cre转基因小鼠在所有平滑肌细胞中表达Cre重组酶,并且有很好的组织特异性。     

软骨组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的研制和鉴定

构建了含有软骨组织特异性Ⅱ型胶原A1启动子和Cre重组酶基因的转基因载体pcol2Al-Cre。323枚小鼠受精卵经显微注射引入转基因片段后,分别移植至14只假孕母鼠的输卵管使其发育。共得到仔鼠52只,PCR结果显示其中10只小鼠基因组上有Cre基因的整合,整合率为19．2％。用整合有Cre基因的转基因小鼠与基因组上携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配,以检测Cre酶介导的重组及其组织特异性。PCR结果表明：col2Al-Cre转基因小鼠软骨组织中表达的Cre重组酶成功地介导了LoxP之间的重组。此结果通过Southern杂交得到了进一步的证实。     

肾上腺皮质束状带特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的构建

肾上腺是人体重要的内分泌器官。由于缺乏肾上腺皮质束状带特异性表达Cre酶的工具鼠,目前对肾上腺皮质束状带细胞中特异表达基因的功能缺乏深入的解析。CYP11B1基因编码类固醇11β-羟化酶,该酶是糖皮质激素合成的关键酶,在肾上腺皮质束状带中特异性表达。本研究旨在利用CYP11B1基因在束状带特异性表达的特点,构建在肾上腺皮质束状带中特异性表达Cre重组酶的转基因动物。采用CRISPR/Cas9技术在CYP11B1基因终止密码子位点定点敲入2A-GfpCre表达框,获得CYP11B1-2A-GfpCre同源重组载体,进而构建CYP11B1Cre小鼠,并通过mTmG和LacZ染色确定Cre酶主要表达在小鼠肾上腺皮质束状带。在此基础上,本研究还用该工具鼠与胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase, CTH)条件性敲除鼠交配,获得了肾上腺皮质束状带CTH特异性敲除的小鼠,并证实了该动物肾上腺皮质束状带中CTH表达缺失。以上结果充分说明肾上腺皮质束状带特异性表达Cre重组酶小鼠构建成功。该工具鼠的成功构建,为深入研究肾上腺皮质束状带相关功能提供了有力工具。     

造血干细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

EDAG是在胚胎发育阶段造血干细胞特异性表达的基因.为了在早期造血组织细胞中实现相关基因的条件敲除,构建了含有早期造血组织特异性表达的EDAG启动子和Cre重组酶基因的转基因EDAG-Cre表达载体质粒.通过显微注射的方法将线性化的5.6kb的EDAG-Cre转基因片段导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生小鼠经过PCR鉴定,常规方法培育传代.结果发现,共获得了6只阳性转基因首建鼠,其中4只已经建系并稳定传代.RT-PCR分析表明Cre重组酶基因在阳性转基因小鼠的骨髓、脾脏、胸腺、外周血以及胎肝等组织中均有表达,重组酶活性也在脾和骨髓中获得确认.EDAG-Cre重组酶转基因小鼠的建立,为研究早期造血组织以及造血干细胞特异性基因条件敲除小鼠模型的建立奠定了基础.     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子Ⅸ（human clotting factor Ⅸ,hFⅨ)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子1、内含子1、外显孔子2共约6.7kb片段以及hFLX全长cDNA序列和部分经改造的内含子1的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠（9♂,3♀）,整合率为11.2%,经ELISA和Western blot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFⅨ的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%,FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合小鼠的不同染色体上,结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFⅨ基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFⅨ的生物活性。     

增强子驱动的Cre转基因小鼠的构建及Cre基因的表达鉴定

目的:探索将增强子应用于构建Cre转基因小鼠品系,为以条件基因敲除为基础的基因功能研究提供更多的工具。方法:通过PCR方法从小鼠的细菌人工染色体扩增UH增强子片段,构建含有Hsp68基础启动子、增强子UH、Cre重组酶基因和SV40 polyA的转基因载体pLW400,将3.3 kb的转基因片段通过显微注射导入小鼠受精卵;为了检测Cre在转基因小鼠中的表达,将转基因一代小鼠与纯合子ROSA26报告小鼠(R/R)交配,收集第14 d胚胎期(E14)的舌组织进行LacZ染色检测鉴定。结果:经鉴定,31只子代小鼠中有6只携带外源基因,整合率为19.4%;与R/+对照相比,E14期的双基因型Cre,R/+舌组织为阳性结果(蓝色)。这表明Cre基因在转基因小鼠舌组织内得到表达,并在体内介导ROSA26基因座loxP位点间的重组,且有效删除了2个loxP之间的片段,从而启动了LacZ基因的表达。结论:构建了UH增强子-Hsp68Cre的转基因小鼠,在舌肌中特异表达Cre基因,提示增强子可以被选择应用于Cre转基因小鼠的构建;为舌肌的发育和再生研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌同源重组基因敲除系统的构建和应用

【目的】结核分枝杆菌同源重组效率很低,突变株的构建需要半年之久。本研究的目的在于构建一种用于在结核分枝杆菌中进行基因快速敲除、且易于筛选的高效同源重组系统。【方法】野生型结核分枝杆菌转化含有SacB反向选择标记、且能诱导表达两种同源重组酶gp60和gp61的质粒pSL002。然后分别将靶基因的两个同源臂克隆入到含有hyg(潮霉素)抗性基因和gfp(绿色荧光蛋白)基因的重组质粒pSL001中,再将靶基因同源臂-loxP-hyg-gfp-loxP片段从pSL001切下,转化含有pSL002的野生型结核分枝杆菌,一步得到双交换突变株。再将含有SacB反向选择标记、且表达Cre重组酶的质粒pSL003转化入结核分枝杆菌双交换突变株中,切除两个loxP之间的hyg抗性基因和gfp基因,得到无痕缺失突变株。最后利用含有2%蔗糖的琼脂糖平板去除含有SacB反向选择标记的质粒pSL002和pSL003。【结果】在结核分枝杆菌中成功构建了高效同源重组系统,利用该系统构建了rv1364c、pstP跨膜区、pstP胞外区三个突变株,得到双交换突变株的效率为25%-62.5%,从双交换突变株得到无痕缺失突变株的效率为100%。通过gfp作为荧光标记基因,利用NightSea BlueStar蓝光手电筒和滤光眼镜,可以对平板上的基因缺失株直接进行快速判定。【结论】该同源重组系统利用gp60和gp61重组酶,在时间上将在结核分枝杆菌中无痕缺失突变株的构建从6个月缩短到3个月。这是目前为止在结核分枝杆菌中构建突变株最快且效率最高的方法,为加速分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工具。     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。