在细菌中表达真核基因的方法

本文叙述使无性繁殖的真核基因在大肠杆菌(E.coli)中获得有效表达的方法。这些方法要求在所讨论的基因的编码序列中,扦入了若干序列(例如一个互补的DNA无性繁殖系)之后形成的一种不间断的形式,在功能上仍然是有效的。合成的基因产物没有同其它的氨基酸序列融合。这种遗传操作是比较简单的,但需要本文所描述的一类质粒和商品化的有用的酶。     

大豆异黄酮合酶基因的克隆及序列分析

目的:大豆异黄酮是多酚类混合物,有防治肿瘤发生,提高机体免疫力等多种保健功能。异黄酮合酶(isoflavone synthase,IFS)是合成异黄酮的关键酶。本文为了利用异黄酮的特有生物学功能,从大豆中克隆了该基因。方法:采用PCR扩增从大豆[Glycine max(Linn.)Merr.]总RNA中分离了异黄酮合酶基因,并将其克隆到pUCm-T载体并测序。结果:得到全长1583bp的片段。以期用于构建诱导表达基因敲除系统,并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。结论:序列分析表明,异黄酮合酶基因(IFS1)含1583个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为92%。     

人αD型基因工程干扰素的研制在北京通过鉴定

由中国预防医学中心病毒学研究所和中国科学院上海生物化学研究所共同协作完成的国家科委重点攻关项目“人aD型基因工程干扰素的研制”,于2月12日在北京通过专家们的鉴定。 该研究首先建立了人白细胞干扰素高效诱生系统,从新城疫病毒诱生的人脐血白细胞中提取及纯化12S聚(A)RNA,经反转录后,建立了人白细胞干扰素基因无性繁殖系;经酶谱及部分DNA序列分析,证明所克隆的人干扰素基因属aD型。通过一系列的基因操作,使人aD型干扰素基因在原核细胞中获得高效     

烟草病程相关蛋白基因启动子的克隆及序列分析

在植物的防御反应中,会诱导产生一些宿主编码的蛋白,叫做病程相关蛋白。该文通过PCR扩增,从烟草(Nicotiana tobacwn ce.Samsun)中克隆了水扬酸诱导表达的PR—1a基因的两个启动子TP12及TP13。以期用于构建诱导表达基因敲除系统,并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。序列分析表明,启动子TP12含1313个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为98．6％;TP13含654个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．4％。     

分子无性繁殖在基因治疗上应用的可能性

Ⅰ、前言 近来发展的分子无性繁殖或重组DNA技术可用来分离、扩增和鉴定为人类特定蛋白质编码的DNA序列--基因治疗的首要步骤,本文集中叙述分子无性繁殖的近来发展,并叙述利用分子无性繁殖怎样分离人类的特定基因以及对人类遗传性疾病进行分子治疗的新进展。至于分子无性繁殖技术是否允许这样来应用,从伦理学上、政治上和社会方面发表了一些文献。其中一些作者间发生了争执。本文只强调技术方面的问题。     

羊驼性别决定基因sry部分片段的克隆与序列分析

从成年羊驼血液提取基因组DNA,参照哺乳动物sry(sex-determining region on the Y chromosome)基因的同源保守区域设计特异性引物,用PCR技术成功扩增羊驼sry基因的部分片段,且全部实验雄性个体均成功扩增,而雌性个体则无任何特异性片段,说明所扩增基因片段具雄性特异性。对扩增序列所编码蛋白序列分析显示所扩增的片段编码的蛋白序列在哺乳动物sryHMG-box(high mobility group box)蛋白超家族的HMG-box区域,说明扩增的为sry基因片段。用所扩增片段与其他哺乳动物同源序列分析显示,由sry基因构建的系统进化树,与传统的动物分类关系相近,说明由sry基因的HMG-box构建系统树是分析物种亲缘关系的有效工具。     

分子无性繁殖在基因治疗上应用的可能性

Ⅰ、前言 近来发展的分子无性繁殖或重组DNA技术可用来分离、扩增和鉴定为人类特定蛋白质编码的DNA序列——基因治疗的首要步骤,本文集中叙述分子无性繁殖的近来发展,并叙述利用分子无性繁殖怎样分离人类的特定基因以及对人类遗传性疾病进行分子治疗的新进展。至于分子无性繁殖技术是否允许这样来应用,从伦理学上、政治上和社会方面发表了一些文献。其中一些作者间发生了争执。本文只强调技术方面的问题。     

一种新的等温单向生长基因合成法初步探索

基因合成正日益成为基因获取的一种有效手段。两种常用的基因合成方法是基于PCR的基因合成（P法）和基于连接酶的基因合成(L法)。这两种方法都不是独立于所合成基因的序列内容的。文章首次提出了一种新的基因合成策略—等温单向生长法(Isothermal Unidirectional Elongation Method, IUEM), 在3种酶的作用下, DNA链在等温状态下单向串行延伸, 直到获得目标基因。由于引物设计成特殊的发夹结构, 该方法可以做到合成过程独立于或部分独立于目标基因的序列内容。本文探索了该策略的实验可行性, 检测了影响基因合成的各种因素, 并利用该方法成功地合成了一段254 bp和一段300 bp的DNA序列。     

微囊藻毒素降解酶基因cDNA部分序列的克隆及检测分析

微囊藻毒素降解酶 (Microcystinase, MlrA) 是在自然环境中微囊藻毒素 (Microcystin, MC) 降解过程中起重要作用的酶。通过PCR方法从水体中扩增MlrA基因cDNA部分序列,序列长342 bp,编码113个氨基酸 (GenBank号:FJ972202),PCR方法系统性检测不同季节环境中水体、鱼体MlrA的存在情况。结果表明,克隆的序列与日本学者Saito所公布的 Sphingomonas sp. MD-1、Y2菌株的MlrA基因同源性高达96%和89%,与挪威 Sphingomonas sp. ACM-3962、澳大利亚 Sphingopyxis sp. LH21菌株的MlrA基因同源性分别为95%和94%,确定所获为鞘氨醇单胞菌菌株中的MlrA基因cDNA部分序列。同时对不同季节环境水体和部分鱼体MlrA基因的检测时,发现在水华发生的四月及五月,水体和所检测的鱼体中MlrA基因结果显示为阳性,而所检测的其余6个月份的全部水样以及7月和10月检测的鱼样,结果均呈阴性。     

唐鱼b-actin基因近端和远端启动子的鉴定及其启动活性分析

利用高保真PCR技术获得唐鱼(Tanichthys albonubes)长为1.3 kb的b-肌动蛋白(b-actin)近端启动调控序列(TA, 1.3 kb)。在此基础上采用基因组步移技术(Genome walker)获得5￠侧翼上游序列1.7 kb, 再根据所获的近端启动子序列和上游序列设计引物, 扩增获得全长为3.0 kb的唐鱼b-actin基因远端启动调控序列(TLA, 3.0 kb)。此1.3 kb和3.0 kb启动调控序列均包含3个转录活性元件: CAAT Box(-89~-85), CArG Box (-59~-49), TATA Box(-26~-20)。利用启动子分析软件TRANSFAC 6.0分析, 结果显示启动调控序列(-105~1261)中含有E-Box、NF-Y、Sp1等多个重要转录因子结合位点, 在远端启动调控序列(-1719~1261)中还含有更多的重要转录因子结合位点。将这两个序列分别定向克隆到红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达载体中, 构建重组表达载体pTLA-DsRed和pTA-DsRed, 并分别注射到唐鱼受精卵中, 结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼的阳性率较转pTA-DsRed的高, 且所发出的红色荧光的强度也比后者的强。采用RT-PCR检测孵化后第15天的转基因唐鱼中RFP的mRNA, 结果显示转pTLA-DsRed基因唐鱼中RFP mRNA的表达量比转pTA-DsRed基因唐鱼高35.7%。结果表明两种长度的启动调控序列均能有效驱使外源基因在唐鱼体内表达, 且长度为3.0 kb的启动子序列具有更强的驱动活性。     

噬菌体T4脱氧胞苷酸羟甲基化酶基因与免疫基因在大肠杆菌“极大细胞”中的表达

本文用“极大细胞”的方法研究噬菌体T4脱氧胞苷酸羟甲基化酶基因(基因42)与免疫基因(基因imm)的表达。从无性繁殖系CC20中提取带有噬菌体T4基因42和基因imm的重组质粒pHC20,转化到大肠杆菌CSR603(recA~-、uvrA~-、phr-1~-)中。转化于经紫外光照射后继续培养,使细胞在染色体降解的同时扩增了质粒DNA。用~(35)S标记质粒编码的蛋白质,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影鉴别噬菌体T4基因42与imm的产物,其分子量分别为25,500和38,500道尔顿。实验结果表明噬菌体T4基因42与imm在大肠杆菌“极大细胞”中表达。在一定条件下,“极大细胞”是研究基因表达的一个比较方便的体系。     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因的克隆及序列分析

目的-克隆阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(AK)基因,并测定其序列,进行序列分析。方法-根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T simple载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性。结果-PCR扩增得到特异的阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的PT-AK重组质粒。测序表明,所克隆的AK基因大小为690bp,编码229个氨基酸。序列分析表明,所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性(99．9％)。结论-克隆了阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因,序列测定及同源性分析表明,所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列具有高度同源性。     

巴西橡胶Pto类抗病同源序列的克隆与系统发育重建（英文）

番茄Pto基因是一类可以编码丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)序列的广谱抗性候选基因,其序列克隆与鉴定为深入了解番茄的抗病机制奠定了基础。在该研究中,一对依据Pto基因的保守序列设计的简并引物被用来扩增巴西橡胶中Pto基因抗病同源序列,扩增得到了一个约550 bp的基因片段,其随后被克隆并测序。序列分析发现,其中的7个抗病同源序列与Pto基因高度同源(BLASTX E value3e-53),所以其被认为是Pto基因抗病同源序列(Pto-RGCs)。通过巴西橡胶的Pto-RGCs多序列比对表明,这些序列包含了多个STKs保守的次级结构域。此外,系统发育分析也表明,巴西橡胶的Pto-RGCs属于Pto基因同源的R基因。该研究结果中Pto-RGCs可为巴西橡胶抗病的发展提供一个有效的基因资源。     

大肠杆菌噬菌体T4基因42和43DNA片段无性繁殖系的鉴定和分析

含胞嘧啶的T4 DNA用核酸内切酶Eco RI、Sal Ⅰ、和Hind Ⅲ切割,特别是用Eco RI不完全切割,所得片段以质粒pBR 322作载体,在大肠杆菌E.coli KH 802菌株中进行了无性繁殖。5,000个无性繁殖系经标记获救法作遗传鉴定,筛选基因42和43的无性繁殖系,并对其所带T4 DNA片段的图位和有关基因的功能表达进行了初步分析。试验证明,10个无性繁殖系带有基因43片段,其中CC-20还带有全部imm基因及基因42;基因43内B22和B263突变位点之间有一个Eco RI酶切位点,基因42或imm内也有一个酶切位点,无性繁     

棉铃虫酚氧化酶原基因的克隆、序列分析和组织表达

利用RT-PCR和RACE方法,获得了棉铃虫Helicoverpa armigera酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)基因一个亚型cDNA的完整序列。该序列全长2 405 bp,含有一个2 097 bp的开放阅读框,编码一个由698个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性(76％～80％),同时该序列具有铜离子结合位点等PPO基因所具有的典型特征。组织特异性表达分析表明,该基因在棉铃虫血细胞、体壁和中肠中均有表达。     

用PCR-RFLP方法研究藏族HLA-DQA1和-DQB1基因多态性

应用目前HLA研究领域中成熟的,有效的PCR-RFLP基因分型技术,从DNA水平对藏族健康群体进行了HLA-DQA1(49人)和-DQB1(49人)基因分型,这在国内外属首次。所采用的PCR-RFLP基因分型技术是在HLA-DQA1和-DQB1各等位基因全部序列已知的情况下,对其第2个外显子碱基序列扩增进而进行RFLP分析的方法。这种方法得到的RFLP的所有片段都是已知序列,因而精确度很高,同时为发现新的等位基因提供了成熟而有效的分析方法。研究结果表明,在藏族DQA1的8个等位基因,DQA1*0301的基因频率最高(36.74％)。DQA1*0601(4.08％)、*0103(4.08％)和*0401(5.10％)最低。在DQB1的16个等位基因中,OQB1*0302(16.33％)、*0303(15.31％)和*0602(15.31％)为最常见,没有观察到*0504。统计分析表明,在DQA1各等位基因分布上,藏族与新疆汉族、北方汉族、上海汉族十分相近;与维吾尔族和哈萨克族也没有明显差异。在OQB1各等位基因的分布上,藏族与汉族、维族、哈族之间略有差异,而汉族、维族、哈族之间也存在一些差异。     

巴西橡胶Pto类抗病同源序列的克隆与系统发育重建

番茄Pto基因是一类可以编码丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)序列的广谱抗性候选基因,其序列克隆与鉴定为深入了解番茄的抗病机制奠定了基础.在该研究中,一对依据Pto基因的保守序列设计的简并引物被用来扩增巴西橡胶中Pto基因抗病同源序列,扩增得到了一个约550 bp的基因片段,其随后被克隆并测序.序列分析发现,其中的7个抗病同源序列与Pto基因高度同源(BLASTX E value <3e-53),所以其被认为是Pto基因抗病同源序列(Pto-RGCs).通过巴西橡胶的Pto-RGCs多序列比对表明,这些序列包含了多个STKs保守的次级结构域.此外,系统发育分析也表明,巴西橡胶的Pto-RGCs属于Pto基因同源的R基因.该研究结果中Pto-RGCs可为巴西橡胶抗病的发展提供一个有效的基因资源.     

美洲华人生物科学学会第一次国际学术讨论会概况

本会由美国和加拿大的美藉华人生物科学家组成,这次是该会组织的第一次大型学术会议,于6月30日至7月2日在旧金山州立大学举行。会议内容包括肝炎、寄生虫学、基因调控、基因无性繁殖、人类遗传病、植物科学、中药研究、神经传递等专题,我们主要参加了肝炎和基因无性繁殖两个专题的活动。 一、乙型肝炎与肝癌 1.分子生物学 在这方面值得重视的有三篇报告:W.J.Rutter报告乙肝基因组的“前核心序列”具有分泌信号的作用。应用包括“前核心序列”的基因转染哺乳动物细胞时核心抗原存在于细胞内质网上,     

小鼠单个植入前胚胎cDNA文库的构建及应用

哺乳动物合子基因组激活和植入前胚胎阶段特异性表达基因的研究一直是发育生物学研究的重点。发现和克隆植入前胚胎阶段特异性表达的基因需要有效的方法,阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种较好的方法。用小鼠单个成熟卵细胞、受精卵、2细胞、4细胞和8细胞胚胎分别构建了cDNA文库。滴度分别为:62×105、83×105、104×106、151×106和162×106。随机挑选了29个克隆并进行了序列分析,结果表明,和已知表达序列标签(ESTs)同源的序列为6552%(1929),未知序列为1379%(429),并发现了2个重复序列。用特异性引物,分别对小鼠持家基因(βactin)和发育特异基因(OCT4)进行PCR扩增,结果表明,所建立的cDNA文库可以反映小鼠胚胎在不同发育阶段整个基因群体的转录活性,为阶段特异性基因的筛选和小鼠早期阶段基因表达模式的研究提供了一种有价值的资源库 。     

兽疫链球菌透明质酸合成相关基因hasB的克隆以及性质研究

透明质酸是链球菌荚膜的主要组成部分,有着重要的生理功能。UDP-葡萄糖脱氢酶(HasB)是透明质酸合成中的一个关键酶,而C类链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因(hasB)尚未被克隆。通过hasB基因的上下游序列设计引物从兽疫链球茵的基因组中克隆出一段序列,测序结果显示其包含一个由1206个碱基组成的开放阅读框,所编码的蛋白序列同化脓链球菌和乳链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶蛋白序列分别有63．1％和70．6％的相似性。将这段基因置于T7启动子下,并在大肠杆菌中进行表达,能够得到一个约47kDa的蛋白,酶活测定显示其具有UDP-葡萄糖脱氢酶活性。这些结果表明所克隆的基因是兽疫链球菌的UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因。