不同pH调节剂对补料批式发酵产1,3-丙二醇的影响

对肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）发酵生产1,3-丙二醇（1,3-Propanediol,1,3．PD）的补碱策略进行了研究。分别利用NaOH、氨水、KOH三种溶液作为pH调节剂,优化三种pH调节剂并得到按一定比例混合的混合碱。当采用混合碱调控发酵pH值为7．0时,1,3-丙二醇的产量达到了55dL,比无pH调控（对照）发酵过程发酵水平提高了10．6倍。     

利用甘油发酵耦联生产3-羟基丙酸及1,3-丙二醇重组菌的构建及筛选

在肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)代谢甘油生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的过程中,为了减少有毒中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)的积累,可将其转化为3-羟基丙酸(3-HP),从而实现1,3-丙二醇和3-羟基丙酸的联产。克隆来自于酿酒酵母的NAD+依赖型的乙醛脱氢酶(ALDH)的基因aldh4,构建了表达载体pKP-aldh,转化K.pneumoniae,得到了有效表达乙醛脱氢酶的重组肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae A+)。在此基础上,使用紫外诱变联合菌种驯化的方法对K.pneumoniae A+进行筛选,获得了可耐受较高3-HP浓度(≥35 g/L)的重组肺炎克雷伯杆菌K.pneumoniae A+5-3。发酵实验结果表明,K.pneumoniae A+5-3可将3-HPA转化为3-HP,能够同时利用甘油耦联生产3-HP和1,3-PD,产量分别达到5.0 g/L和74.5 g/L。     

1,3-丙二醇产生茵基因组重排育种

[目的]本文以肺炎克雷伯氏杆菌为研究对象,利用基因组重排技术,提高其对发酵体系中主要产物的耐受性,获得1,3-丙二醇高产菌.[方法]以含预处理后的出发菌株的补料发酵终点液的96孔板为筛选方法,利用基因组重排技术育种.[结果]筛选到的5株高产菌株(LSG1,LSG2,LSG4,LSG5,LSG6),在3升罐批次发酵中的1...     

pH值对Klebsiella pneumoniae合成1,3-丙二醇中心碳代谢的影响

目的：生物法合成1,3-丙二醇时,pH值对于产物谱有着显著影响。本文将研究不同pH值对克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）的中心碳代谢的影响。方法：设计单因素试验,控制发酵pH值,用5L Braun发酵罐进行批次发酵,分析发酵过程中产物时序性合成的特性。结果：pH 6.2到7.4适合菌体生长;不同pH值对于葡萄糖消耗无明显差异;pH6.8时能在较长时间保持在高水平的甘油比消耗速率;在偏碱性条件下,有机酸丁二酸、乳酸、乙酸的比生长速率显著增大;而2,3-丁二醇在偏碱性的pH7.4和8.0时根本不能合成。pH6.8时1,3-丙二醇的得率最大,不同pH条件下碳回收率相当。结论：证明了pH值对K. pneumoniae中心碳代谢具有显著影响,不同产物呈现不同的合成动力学特性,其详细机理有带进一步深入研究。     

鸟苷补料分批发酵的研究

目的:以枯草芽孢杆菌TA208为出发菌株,研究了补料分批发酵方式下各种参数对鸟苷产量的影响。方法:采用补料分批发酵工艺,利用纸层析法测定发酵液中鸟苷的产量。结果:确定了葡萄糖、酵母粉和次黄嘌呤的最优补料方式,使鸟苷产量达到32.05g/L,较分批发酵方式提高了36.3%。结论:发酵工艺过程控制对发酵生产鸟苷具有重大影响。     

粗甘油发酵生产1,3-丙二醇的研究进展

粗甘油是生物柴油工业生产中的主要副产物,通过微生物发酵直接将其转化成高值化学品1,3-丙二醇,是其绿色高值化利用的有效途径。对微生物代谢甘油产1,3-丙二醇途径及关键酶、粗甘油杂质对微生物发酵影响、不同微生物直接发酵粗甘油生产1,3-丙二醇以及混菌发酵粗甘油提高1,3-丙二醇产率等方面的最新研究进展进行了综述,旨在为直接发酵粗甘油生产1,3-丙二醇的工程菌株开发及其工业化应用提供参考。     

原生质体紫外诱变技术选育1,3-丙二醇高产菌株

以肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)为研究对象,应用原生质体紫外诱变技术提高其对甘油及1,3-丙二醇的耐受性,获得1,3-丙二醇高产菌.在原生质体制备过程中,运用滤膜去除酶解后细胞悬液中的正常菌体,简化菌体酶解过程,提高再生率及形成率.经过原生质体诱变后,以耐受高浓度甘油和1,3-丙二醇及高产酸能力为筛选方向,最终筛选到了3株高产菌株(Kp-1、Kp-4和Kp-5).在补料发酵实验中,上述诱变菌产1,3-丙二醇能力分别为70.24 、65.21和75.51 g/L,比野生菌株WT(55.78 g/L)分别提高了25.92%、16.91%和35.37%.     

提高肺炎克雷伯氏菌产1,3-丙二醇的分子生物学方法研究进展

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)可用于工业合成多种化合物,包括聚酯、聚醚和聚氨酯。发酵法生产1,3-PD具有巨大潜力。本文从代谢途径分析入手,梳理了肺炎克雷伯氏菌厌氧代谢途径的相关酶及催化作用,较详细地综述了其产1,3-PD关键酶的分子改造、基因工程菌株的构建和关键酶基因表达、副产物相关代谢酶基因敲除等方面的最新进展,并展望了其今后的发展前景。     

混合菌发酵1,3-丙二醇的初步研究

将表达酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD1)和3-磷酸甘油酯酶基因(HOR2)的质粒PSE-gpd1-hor2转化到甘油激酶基因(glpK)和甘油脱氢酶基因(gldA)双缺失的大肠杆菌JM109C中,构建产甘油的工程菌JM109C/PSE-gpd1-hor2.接种JM109C/pSE-gpd1-hor2和Klebsiella在含1%葡萄糖的摇瓶发酵培养基中37℃发酵56 h,1,3-丙二醇的最高产量为1.28 g/L,葡萄糖摩尔转化率为37.5%;在30 L发酵罐中发酵68 h,1,3-丙二醇的最高产量为24.09 g/L,葡萄糖摩尔转化率为38.0%;5 g/L的乙酸、乳酸,10 g/L的乙醇分别使1,3-丙二醇的产量降低了91.41%、54.68%和51.56%.     

1,3-丙二醇发酵中甘油代谢及产物抑制作用

对微生物法甘油转化成1,3-丙二醇过程中代谢规律及代谢控制的相关酶作以简述,并着重分析了丁酸梭菌发酵生产中乙酸、丁酸等副产物对细胞的抑制作用,对未来的研究发展方向进行了展望。     

克雷伯氏肺炎杆菌LDH526产1,3-丙二醇的甘油自动流加策略

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,主要作为平台化合物用于合成聚酯,如聚对苯二甲酸丙二醇酯。经基因工程改造的克雷伯氏肺炎杆菌LDH526能以甘油作为唯一碳源合成1,3-丙二醇,最终发酵浓度超过90 g/L。甘油浓度是影响1,3-丙二醇合成的关键因素。为了实现对甘油浓度的精确控制,设计并优化了基于发酵动力学的甘油自动流加策略。通过将底物流加速率与易观察变量p H和发酵时间偶联,实现了发酵过程中甘油流加的自启动和甘油浓度的动态控制。发酵72 h,1,3-丙二醇的浓度可稳定超过95 g/L。自动控制甘油流加的发酵过程具有可重复性、连续性以及人工工作量少的特点,有望从实验室规模扩大到生产规模。     

pH对克雷伯氏菌1,3-丙二醇合成关键酶酶活及发酵特性的影响

在5 L发酵罐进行甘油脉冲流加发酵,分析了不同pH值对克雷伯氏肺炎杆菌发酵特性的影响,pH 6.5为菌体最佳生长条件,克雷伯氏肺炎杆菌合成1,3-丙二醇的产量最高。在1,3-丙二醇合成速率较大的对数中前期,进行甘油脉冲流加发酵,提高甘油浓度促进甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶活性。不同pH值的脉冲试验表明,甘油脱水酶,2,3-丁二醇脱氢酶比酶活随着pH值的升高而升高,1,3-丙二醇氧化还原酶,乳酸脱氢酶比酶活在pH6.5最高,因此偏酸性的发酵条件和对数期维持一定的甘油浓度能够促进1,3-丙二醇的合成。     

微生物发酵法生产1,3-丙二醇的研究新进展

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,广泛应用于医药、化工、食品及化妆品等行业,同时1,3-PD是合成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的重要单体,市场需求量逐年增多。基于生态友好型、生产安全和可持续发展的要求,利用微生物转化可再生资源来生产1,3-PD受到了人们的广泛重视。综述了微生物发酵法生产1,3-PD的菌株、代谢途径、发酵和下游分离工艺及其新进展,并对工业生产中利用生物技术生产1,3-PD的未来前景和挑战进行了探讨。     

一株产1，3-丙二醇的克雷伯氏菌的噬菌体生物学特性

[目的]克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇过程中发生噬菌体感染会严重影响宿主菌的生长和目标产物的生成,因此分离克雷伯氏菌噬菌体并考察其生物学特性对预防和控制噬菌体感染具有重要意义.[方法]采用敏感指示菌法及Adams双层平板法从感染噬菌体的肺炎克雷伯氏杆菌发酵液中分离得到一株噬菌体;纯化后用磷钨酸负染法电镜观察;手工法提取噬菌体核酸,酶切后琼脂糖凝胶电泳分析;同时考察了其最佳感染复数、一步生长曲线及对温度、pH、紫外线、乙醚和氯仿等理化因素的敏感性等生理特性;最后考察了噬菌体对肺炎克雷伯氏杆菌生长和发酵的影响.[结果]分离出一株肺炎克雷伯氏杆菌溶源性噬菌体,其噬菌斑为无晕环透明圆斑,直径约1.5 mm;其头部为直径约60 nm-70 nm的球体,有一长约160 nm的丝状长尾;基因组核酸能被双链DNA内切酶EcoR Ⅰ及HindⅢ切开,大小约42 kb;对高温和紫外线敏感,耐碱性而受强酸抑制,对氯仿不敏感;最佳感染复数为1,潜伏期与裂解期均为50 min,裂解量为343个;感染噬菌体的肺炎克雷伯氏杆菌的细胞生长延滞约8h,代谢流偏向乳酸途径.[结论]该噬菌体属于无包膜长尾噬菌体,能改变克雷伯氏菌发酵生产1,3-丙二醇的代谢规律,为1,3-丙二醇发酵生产过程中噬菌体感染的预防和控制研究奠定了基础.     

Multiple growth inhibition of <Emphasis Type="Italic">Klebsiella pneumoniae</Emphasis> in 1,3-propanediol fermentation

The inhibition of substrate and product on the growth of Klebsiella pneumoniae in anaerobic and aerobic batch fermentation for the production of 1,3-propanediol was studied. The cells under anaerobic conditions had a higher maximum specific growth rate of 0.19 h^–1 and lower tolerance to 110 g glycerol l^–1, compared to the maximum specific growth rate of 0.17 h^–1 and tolerance to 133 g glycerol l^–1 under aerobic conditions. Acetate was the main inhibitory metabolite during the fermentation under anaerobic conditions, with lactate and ethanol the next most inhibitory. The critical concentrations of acetate, lactate and ethanol were assessed to be 15, 19, 26 g l^–1, respectively. However, cells grown under aerobic conditions were more resistant to acetate and lactate but less resistant to ethanol. The critical concentrations of acetate, lactate and ethanol were assessed to be 24, 26, and 17 g l^–1, respectivelyRevisions requested 8 september; Revisions received 2 November 2004     

利用PDOR同工酶基因yqhD对产1,3-丙二醇克雷伯氏杆菌进行基因工程改造

由于Klebsiella pneumoniae 1,3-丙二醇合成途径中,加强甘油脱水酶基因表达,导致因NADH供应不足使3-羟基丙醛累积,并对菌体生长及1,3-丙二醇合成造成负面影响。为改善Klebsiella pneumoniae 1,3-丙二醇合成途径,本文利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出以NADPH 为辅酶的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,从克雷伯氏杆菌中扩增出2.66kb的甘油脱水酶基因（dhaB）,构建了产1,3-丙二醇关键酶基因的串联载体pEtac-dhaB-tac-yqhD,并将其转入到野生克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)中,重组载体得到了表达。通过初步发酵,重组后的克雷伯氏杆菌产量比原始菌高20%左右,副产物中乙酸和丁二醇分别下降30%左右。     

新型复合诱变法筛选高产1,3-丙二醇菌株

为提高肺炎克雷伯氏茵生产l,3-丙二醇的能力,使用一种新型的以氮气为工作气体的等离子体复合紫外的诱变系统(MPMS-UV)对菌种进行诱变.用含有90g/L～100g/L1,3-丙二醇的选择培养基进行筛选驯化,最终获得一株高产PDO且甘油利用率高的优良菌株k2.2L批式流加发酵结果表明,该菌株PDO产量为69.71 g/L,摩尔产率为0.57 mol/mol,比原始菌株分别提高了44.7％和21％.     

Enhancement of 1,3-propanediol Production by <Emphasis Type="Italic">Klebsiella pneumoniae</Emphasis> with Fumarate Addition

Addition of 5 mm fumarate to cultures of Klebsiella pneumoniae enhanced the rate of glycerol consumption and the production of 1,3-propanediol (PDO). Compared to the control, the activity of glycerol dehydrogenase increased by 35, 33 and 46%, the activity of glycerol dehydratase increased by 160, 210 and 115%, and the activity of 1,3-propanediol oxidoreductase increased by 25, 39 and 85% when, respectively, 5, 15 and 25 mm fumarate were provided. At the same time, the ratio of NAD⁺ to NADH decreased by 20, 23 and 29%. Using a 5 l bioreactor with 5 mM fumarate addition, the specific rate of glycerol consumption and the productivity of PDO was 30 mmol/l h and 17 mmol/l h, respectively, both increased by 35% over the control. Revisions requested 15 July 2005; Revisions received 30 August 2005     

克雷伯杆菌产1,3-丙二醇关键酶甘油脱水酶的酶活分析方法研究

有氧条件下,建立了克雷伯杆菌破碎方法及其生产1,3-丙二醇代谢途径中关键酶甘油脱水酶的酶活测定方法。甘油脱水酶酶活测定时在超声时间25min,功率为300w的条件下最适破碎频率为破碎时间1s,停息时间4s;甘油脱水酶酶活测定所用磷酸盐缓冲液的最适浓度为0.045mol/L,最适pH值7.2。甘油脱水酶酶活测定反应的最佳温度为37℃,甘油脱水酶酶活测定反应液的最佳吸收波长为290nm。