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《生物技术世界》2014,(11)
目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。 相似文献
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噬菌体T7溶菌酶基因的克隆 总被引:2,自引:1,他引:1
以Pbr322及含有噬菌体T7 RNA聚合酶强启动子φ10的Pbr322衍生物作为克隆载体,经限制内切酶AvaⅡ+HaeⅢ切割的一段噬菌体T7 DNA片段分别克隆到Pbr322及其衍生质粒的BamHⅠ位点上。插入的DNA片段为632碱基对。该片段包括噬菌体T7基因3.5和T7 RNA聚合酶弱启动子φ3.8的全部编码序列。已知噬菌体T7基因3.5的功能为产生噬菌体T7溶菌酶,利用氯仿处理检测带有重组质粒的转化子胞内溶菌酶活力。证明两种克隆株整体细胞中,均有溶菌酶存在。用10一20%SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳检查噬菌体T7基因3.5蛋白带,结果表明T7基因3.5在Pbr322衍生质粒中的表达优于Pbr322。 相似文献
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《生物技术通报》1993,(3)
950857转化群母曹的简簟而有效的方法[英]/Elble,R./BioTechniques.一1992,13(1).一18~20仁译自D.BA,1992,11(17),92—09534] 这是经简化的醋酸锂方法,每份样品仅需2~3分钟的处理。无论酵母菌处于什么生长期都可被转化。从O.5ml培养液得到细胞团,加上lO声1载体DNA(100#g)和lpg转化DNA。加O.5ml PEG一醋酸钮一。Tris-EDTA缓冲液(pH 7|.5),然后在室温下过夜。从静止液底层取50#1混合物直接涂在选择平板上。每芦g质粒pCD4 DNA可使酿酒酵母菌株8534.8C的饱和培养物产生7800~24000个转化子。对数生长期产生的转化子数只比静止期… 相似文献
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质粒DNA的提取是最基础的DNA重组技术。国内外已经发展了许多方法用于批量提取质粒DNA。这些方法都可以获得满意的效果。这里介绍两种小量快速提取质粒DNA的方法,可用于重组子筛选及酶切分析。 (一)碱裂解法 1.将过夜培养的菌液1.5ml转移到小离心管内,15.000r/min离心30sec,弃去上清,将离心管倒置尽量除去培养液。 2.将沉淀的菌体再悬于100ml冰冷的溶液A中(50mM葡萄糖,25mM Tris pH8.0,10mM EDTA),不必要加入溶菌酶。 3.向A液中加入新配制的溶液B200μl(0.2N NaOH,1%SDS),迅速倒置几次,混合两溶液,放在冰浴上3—5分钟。 4.再加入150μl溶液C(5M醋酸钠60ml,冰醋酸11.5ml,蒸馏水28.5ml)混均后冰浴3~5分钟。 相似文献
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迄今文献中报道枯草杆菌基因克隆化都采用枯草杆菌168株及其突变体。本文采用我国分离的枯草杆菌Ki-2株及其突变体Ki-2-1 32(Thr~-Ile~-Val~-)和Ki-2-148(ura~-)为pUB110质粒DNA的受体菌株。用酸酚法提纯pUB110质粒DNA,在琼脂糖凝胶电泳上看不到样品中有染色体DNA的带。结果表明,Ki-2、Ki-2-132和Ki-2-148都可作pUB 110质粒的受体菌,其转化频率在10~(—3)—10~(—8)之间,因菌株和条件不同,频率有所差异。Ki-2-132的转化效率为每微克DNA可产生10~4转化体。pUB 110质粒DNA浓度在0.01—1.00μg/ml之间时,转化体数目随DNA浓度增加而增加,其中,在浓度为0.01—0.1μg/ml之间成直线关系,测定的DNA依赖指数为1.04,系一级反应。从pUB110质粒DNA转化168、Ki-2、Ki-2-132、Ki-2-148的转化体中提取的质粒DNA仍具有pUB110质粒DNA的抗卡那霉素的转化活性。从转化体提纯的质粒DNA的电泳图以及EcoRI消化后的电泳图与原来的pUB110 DNA的电泳图相同。 相似文献
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质粒的提取与纯化是基因工程的重要内容。我们用昆虫杆状病毒BsNPV DNA的Bam HI片段与质粒pBR322重组得到重组体pBSa18和pBSb36。用LB摇床培养。 质粒pBR322 DNA用Gonzalls等(1980)的常规法提取。重组质粒的提取是离心40ml培养液收获细胞,加pH7.8 4×TEA缓冲液50ml,GSE(甘油50%,SDS 5%,EDTA0.1M)18ml,70℃保温10分钟,-20℃冷冻过夜,次日在4℃离心12 000r/min15分钟,取上清直接进行制备性琼脂糖凝胶电 相似文献
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多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20%左右,形成率在95%以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。 相似文献
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用来自变铅青链霉菌TK24的质粒plJT02(tsr、mel~+)转化吸水链毒菌应城变种10-22的原生质体,未能得到转化子。但改用来自弗氏链霉菌ATCC 10745的plJ702转化10—22原生质体却得到了转化子。转化频率约10 ~3—10~4转化子/微克DNA。在这些转化子中,只有约1/1000是黑色菌落(mel~+),绝大部分为白色菌落(mel~-)。分别挑出黑色、白色2种菌落,只有从前者能提出电泳可见的plJ702质粒带。2种菌落的质粒提取物,均能转化TK24原生质体并正常表达黑色素。在非选择性条件下,从10-22(pIJ702)黑色菌落的群体中,获得了少数白色菌落,经证明它们是10-22的宿主突变体。这些突变体的plJ702转化子出现均一的黑色菌落。 相似文献
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酿酒酵母超氧物歧化酶(SOD)基因的克隆和表达 总被引:7,自引:0,他引:7
通过PCR扩增技术从酿酒酵母中得到了Cu,zn—SOD的结构基因,此基因被亚克隆到大肠杆菌质粒载体pT7—7.得到重组质粒pT7-7:SOD。利用EcoRI和Pstl酶切pT7-7::SOD质粒.经琼脂糖凝腔电泳,DEAE-滤膜回收Cu。zn—SOD结构基因片段,将其亚克隆到M13中.并转化大肠杆菌,得到了重组质粒M13-::t SOD,酶切和纯化后的SOD基因,定向克隆到酵母质粒载体pHz-8的smal和EcoRI位点上,构建成重组质粒pHZ-8-l。经转化酵母受体菌ZH-l和DP—l后得到了转化子.来自于ZH—l的转化子在非选择性条件下培养40世代后仍有95%以上细胞保留重组质粒。而来自于DP-1的转化子很不稳定。经蛋白提取、聚丙烯酰胺凝胶电泳和酶活性测定结果表明,来自于zH-1转化子中SOD的表达量约为细胞可溶性蛋白的15%.并具有生物活性。 相似文献
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一、哺乳类DNA部分酶切片段的回收 1.选定所用的限制性内切酶。将待酶切的哺乳类细胞DNA分别装入6—10个Eppendorf离心管。 2.将限制性内切酶加入装有DNA的离心管。酶量逐级递减,例如1单位/微克DNA,0.5单位/微克DNA,……,37℃保温3—5小时。 3.或将相同的酶量加入装有DNA的离心管,37℃保温。经不同时间终止酶切反应。例如,保温10分钟,20分钟……。 相似文献
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PCR-SSCP分析方法的优化 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:优化PCR-SSCP分析方法。方法:选择野生型Kir2.3质粒和突变型Kir2.3(2123L)质粒为样本,其PCR结果的鉴定采用2%的琼脂糖凝胶EB显色,SSCP分析采用12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶DNA银染显色。PCR产物变性比较了三种方法:即碱变性、SDS变性、直接变性。聚丙烯酰胺凝胶根据丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺及甘油的比例设计了六个实验组,每组采用两种条件电泳,即:30mA恒流快速电泳和100V恒流过夜电泳。结果:选择直接变性的PCR产物作为变性上样液,并确定了三种凝胶配及该条件下适用的电泳条件。即:丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49比1,凝胶中含1%甘油,4℃,500V高压电泳3min接着30mA恒流快速电泳3h;丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49比1,凝胶中含5%甘油,4℃,500V高压电泳3min接着30mA恒流快速电泳3h;丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29比1,凝胶中不合甘油,4℃,500V高压电泳3min接着100V恒流过夜电泳12h。结论:条件优化的PCR-SSCP是一种筛查基因突变简便、有效的实验方法。 相似文献
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将葫芦科植物丝瓜和西葫芦当天开放的新鲜花粉放入0.025M,pH7.8,Tris-HCI缓冲液中,在1—50分钟不等时间内提取(含10%蔗糖,100ppm Ca~( ),100ppm硼)滤液用90%饱和度的硫酸铵沉淀,透析除盐(或过Sephadex G-25凝胶柱),然后在紫外光光度计280nm下测OD值。 不同时间取样测定表明,西葫芦花粉在1分钟内提取的滤液中蛋白质含量已达全部释放的蛋白质的一半左右,以后缓慢增加,20分钟后不再继续释放。 西葫芦花粉渗出液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,考马斯亮蓝染色,可分出明显的7个区带,19条蛋白带。丝瓜花粉经同样处理后也可分出7个区带,18条蛋白带。两者电泳图型不完全一样。 两种植物花粉壁蛋白都显示出中性酯酶、酸性磷酸酯酶同功酶带,但两者都没有碱性磷酸酯酶。 两种植物的花粉壁蛋白的电泳胶条,用过碘酸-Schiff试剂染色后出现三条红色带,表明这部分蛋白质是糖蛋白。蛋白样品经酸水解后纸层析分离,表明两种植物花粉壁蛋白均含有三种糖:半乳糖,阿拉伯糖及一个尚未判明的糖。 两种植物的花粉壁蛋白都有热稳定的成份。 花粉壁蛋白经SDS、β-巯基乙醇凝胶电泳后出现多条染色带,经与在同样条件下电泳的标准蛋白比较,其中主要蛋白的分子量范围为11700—12000、25000、43000、46000和76000道尔顿。 在丝瓜(母本)和南 相似文献
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常用的转化方法是用CaCl_2或CaCl_2/RbCl_2处理受体菌使成感受态。转化率约为10~3—10~6个转化子/μg质粒DNA。近年发展起来的电转化技术可使转化率提高到lC~(?)—10~(10)个转化子/μg质粒DNA。我们以质粒pBR322和大肠杆菌HB101为实验材料,对常用的转化方法和电转化的结果进行了比较,对电转化中获得最佳转化效果和各种参数如电压、脉冲时间、脉冲次数、循环数等进行了探讨。 相似文献
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一种快速简便的CaCl2质粒转化方法 总被引:3,自引:0,他引:3
介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴3~10min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2h减至3~10min.同时探讨了Ca2 浓度、4℃保存时间等因素对感受态细胞转化效率的影响 相似文献