新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究

观察脆弱类杆菌来源的新型重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性.在有选择压力(Kan+)条件下,将重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、平板传代及诱导过程中的质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力检测.结果表明细菌形态、生长速度和抗生素抗性等与原始种子库无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100％,但诱导过程中质粒易丢失.第20、40和60代提取质粒进行酶切检查,酶切图谱没有改变.DNA测序未见α-半乳糖苷酶基因变异.原代菌株及第20、40和60代菌株经诱导培养,其α-半乳糖苷酶表达水平、酶活力及菌体蛋白的SDS-PAGE图谱均无明显差异.说明α-半乳糖苷酶工程菌株在平板传代中具有良好的遗传稳定性     

戊型肝炎病毒（HEV）合成肽及基因重组抗的免疫反应性研究

用ＯＲＦ２、ＯＲＦ３合成肽抗原（１－１０号）及基因工程重组的ＯＲＦ２抗原（１和２号）分别建立了酶联免疫方法（ＥＩＡ）,检测６０份戊型肝炎病人血清中ＨＥＶＩｇＧ及ＩｇＭ１０个合成肽抗原及２人重组抗原,均和ＨＥＶ阳性血清发生特异反应,但阳性率和反应强度差别很大。以Ｒｅｌ（ＯＲＦ２,４０２－６６０）检测的抗体阳性率最高,为９６．７％;Ｓｐ６（ＯＲＦ３,８８－１２３）次之,为９３．３％（５６／６０）;以上     

戊型肝炎病毒(HEV)合成肽及基因重组抗原免疫反应性研究

用ＯＲＦ２、ＯＲＦ３合成肽抗原（１～１０号）及基因工程重组的ＯＲＦ２抗原（１和２号）分别建立了酶联免疫方法（ＥＩＡ）,检测６０份戊型肝炎病人血清中ＨＥＶＩｇＧ及ＩｇＭ１０个合成肽抗原（Ｓｐ１－Ｓｐ１０）及２个重组抗原（Ｒｅ１、Ｒｅ２）,均和ＨＥＶ阳性血清发生特异反应,但阳性率和反应强度差别很大。以Ｒｅ１（ＯＲＦ２,４０２～６６０）检测的抗体阳性率最高,为９６．７％（５８／６０）;Ｓｐ６（ＯＲＦ３,８８～１２３）次之,为９３．３％（５６／６０）;以上两种抗原混合使用阳性率为１００％（６０／６０）。Ｓｐ６、Ｒｅ１及这两种抗原混合使用检测抗ＨＥＶＩｇＭ,阳性率分别为１８．３％（１１／６０）、６６．７％（４０／６０）和６６．７％（４０／６０）。研究结果表明：合成肽６号（Ｓｐ６）及重组抗原１号（Ｒｅ１）是制备戊肝抗体诊断试剂的理想抗原。     

梅毒螺旋体重组抗原酶联免疫吸附试验的建立及应用

建立梅毒螺旋体重组抗原酶联免疫吸附试验（ELISA）,用于梅素血清学诊断和调查。其法,用表达的重组抗原IPN17和TmpA,建立检测血清特异抗体的间接ELISA,并与其它检测方法比较,分别检测梅毒参比血清、病人及献血员血清。其结果,敏感性、特异性均为100％。新建ELISA与TPHA的总符率为95．7％,明显高于RPR与TPHA的总符合率（89．1％）。献血员人群抗体阳性率为0．3％－0．69％,健康人群中抗体阳性率较低。     

TT病毒重组蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,获得了4株稳定分泌抗TTV重组蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,1株属IgG2bλ链、1株属IgG1κ链、2株属IgG2aκ链。4株杂交瘤细胞培养上清液效价为1：80-1：1280,腹水效价为1：32万-1：160万。     

重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的稳定性研究

研究重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)的稳定性.以抗病毒活性和纯度为主要检测指标,考察rHSA-IFNα-2b的热稳定性,酸碱稳定性以及冻融耐受性.rHSA-IFNα-2b在37℃、55℃下放置5h后生物学活性无明显降低,60℃水浴lh即可见活性降低了约40%;pH值(分别为2、3、9)改变时,生物学活性未发生明显变化;rHSA-IFNα-2b反复冻融后聚合体逐渐增加,冻融4次后聚合体含量达到17.91%,但生物学活性无明显降低.重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白对热、酸碱变化稳定,但不宜冻融.     

合成肽抗原在戊型肝炎病毒感染诊断中的应用

An ELISA for the detection of anti HEV using synthetic peptide antigens was developed. The synthetic antigens were encoded by OFR2 and OFR3 genes of HEV. The purpose of this study was to determine the applicability of the synthetic antigens in the serodiagnosis of hepatitis E. The anti HEV detection using synthetic antigens was carried out in 47 healthy subjects and 89 patients with acute or chronic viral hepatitis. The results showed that the positive rate of anti HEV IgG in healthy subjects was 4.2%(2/47), and no IgM antibody to HEV was found. The positive rates of IgG and IgM antibodies to HEV in the hepatitis patients were 8.9% and 10% respectively. In addition, we compared the detecting efficacy of the synthetic antigens with that of the market reagent in 57 serum samples, the total coincident rate was 87.7% (50/57). All of the results accorded with the literatures reported. This study suggests that the ELISA based on the synthetic peptide antigens was specific, sensitive and convenient in diagnosis of HEV infection, it can be widely used in both clinical and epidemiological reseaches.     

肺炎支原体P1重组蛋白的提取纯化及应用研究

提取纯化肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1重组蛋白,建立酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法,协助临床肺炎支原体感染的诊断。以GST融合蛋白层析柱提取、纯化Mp P1重组蛋白做抗原,以全肺炎支原体菌体成分做抗原对照,建立间接ELISA实验方法,检测40份正常献血者血清标本和51份疑似MP感染临床血清标本的IgG抗体。重组蛋白经SDS-PAGE可见诱导表达的样品在分子量大约59 ku处有明显条带,经Western blotting可与肺炎支原体免疫血清发生反应。ELISA实验检测51份临床标本,由P1重组蛋白抗原检测阳性31份,阳性率为60.78%。Mp检测阳性20份,阳性率为39.22%。实验精确度检测阳性混合血清的变异系数(CV值)为5.40%,阴性混合血清变异系数为1.10%。用Mp P1重组蛋白抗原建立的ELISA检测方法,其敏感性高于全肺炎支原体抗原,可用于临床肺炎支原体感染的诊断。     

一株新的重组人源过氧化氢酶基因工程菌的构建和遗传稳定性研究

利用pPICZαA作为新的表达载体和表达宿主酵母GS115,成功地构建了新的人源过氧化氢酶表达工程菌G13,并考察了新的工程菌G13的遗传稳定性.通过对新的重组菌整合质粒的酶切,PCR鉴定,及SDS-PAGE电泳、单抗dot-blot证实了该重组菌质粒构建正确,可以有效表达重组的人源过氧化氢酶.新的重组酵母菌G13在连...     

猪戊型肝炎病毒基因ORF2片段AG02的融合表达及间接ELISA方法的初步建立

采用巢式RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（SHEV）结构蛋白基因ORF2部分片段AG02。将该片段插入pET32a表达载体,命名为PET-HEV,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE-3）,经1mM IPTG诱导得到表达,进行SDS-PAGE分析,证明该片段得到融合表达,分子量为33KD。Western blot分析表明,重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白建立了初步的间接ELISA方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为2.43μg/mL,血清最佳的稀释比为1:40,与万泰试剂盒相比较,证明我们建立的ELISA方法有较高的特异性和敏感性。     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白p239特异性吸附、侵入HepG2细胞并阻断野病毒对肝细胞的感染

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的戊型肝炎在临床症状上与甲肝相似,但病死率更高,妊娠晚期病死率可高达15%～25%[1].近年来,戊肝在世界各地暴发不断;而我国戊肝发病迅速增长,已经成为普遍流行、危害严重的疾病之一[2].     

戊型肝炎病毒抗体(抗-HEV)酶联免疫试剂盒的研制及其应用

应用合成ＨＥＶ多肽作为包被抗原,按间接ＥＬＩＳＡ法,研制成ＨＥＶ抗体检测试剂盒,并用于检测标本１０５４份,其中献血员样品２００份,阳性率为１％;体检样品５０２份,阳性率为１．５９％;医院病人样品３５２份,阳性率为１０．８％。     

抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究

通过 Western blot、体外捕获PCR、ELISA阻断实验及合成的多肽库等方法,对23株抗戊型肝炎病毒(HEV)单克隆抗体(单抗)识别HEV ORF2表位的作用进行系统研究.结果显示,7株线性单抗识别表位都位于ORF2aa408～458之间,16株构象型单抗识别表位都定位于ORF2 aa459～606之间,大部分构象型单抗识别表位都在天然病毒表面.对这些单抗识别表位系统地了解将为HEV疫苗、诊断、病毒受体和病毒感染机制等方面的研究提供重要工具.     

重组人尿激酶原冻干产品的稳定性

目的：探讨重组人尿激酶原（rhPro-UK）冻干产品的稳定性。方法：采用S-2444发色底物法测定贮存在4℃和-20℃的rhPro-UK冻干产品的活性、单链比例随时间的变化规律;用SDS-PAGE及RP-HPLC肽图分析贮存在-20℃的rhPro-UK冻干产品的结构与组成的变化。结果：4℃保存3年后的rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例基本没有变化,但随着贮存时间的延长,有部分产品降解,如贮存78个月的样品,总活性可降低13％～15％;-20℃保存78个月后,rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例未见明显变化。SDS-PAGE及RP-HPLC肽图图谱显示,-20℃贮存78个月后的rhPro-UK冻干产品的组成和结构没有变化。结论：rhPro-UK冻干产品在4℃的贮存寿命可达3年;长期贮存于-20℃的rhPro-UK冻干产品,其总活性、单链比例及结构组成非常稳定。     

戊型肝炎病毒基因片段开读框架3(369bp)的克隆载体及真核表达载体的构建

通过聚合酶链式反应（PCR）技术,以戊肝病毒cDNA为模板将开读框架3的基因片段扩增并克隆入载体pUC18中,再对扩增片段进行酶切鉴定及测序。结果表明此片段与膜板序列的同源性达到99%以上,将此片段克隆后通过一系列分子生物学技术装入真核胞内表达载体PPIC3及分泌性载体PPIC9中,并对载体进行酶切鉴定证实外源基因插入的正确性,最终完成表达载体的构建。     

粗提和纯化的HPV16L1重组蛋白为抗原的ELISA比较

为评价真核及原核细胞表达的HPV16L1粗提蛋白代替纯化的16L1蛋白作为ELISA检测抗原的可行性。实验分别用大肠埃希菌表达的HPV16L1纯化蛋白,表达16L1的大肠埃希菌破碎物及表达16L1的昆虫细胞破碎物作为抗原。在ELISA试验中与抗HPV16L1的单克隆抗体进行反应。结果证实3种包被抗原可以得出非常相近的OD值变化趋势。表明用表达16L1的大肠埃希菌破碎物和表达16L1的昆虫细胞破碎物可以代替纯化的HPV16L1蛋白作为抗原进行ELISA试验。     

克服位置效应提高外源基因在CHO细胞中稳定高效表达的策略

能够生产有功用的治疗性蛋白的一个重要前提是获得稳定的重组蛋白高表达细胞株,然而筛选一个能够持续稳定表达外源蛋白的重组细胞株是费时费力的过程。有多篇文献报道了重组蛋白细胞株表达的不稳定性。位置效应是高表达细胞株不稳定性的重要因素,克服或利用位置效应是当前获得稳定高表达重组蛋白细胞株的有效途径。为解决外源基因插入的随机性所带来的不可预知的后果,可以事先在CHO细胞基因组中筛选转录热点区域,再通过位点特异性或同源重组的方式,实现外源基因的定点整合。各种调节位置效应的DNA元件陆续被发现,可以利用它们去调控基因表达及增加细胞株的稳定性。     

转解毒酶基因工程菌的构建及酶活性分析

实验构建了能高效降解有机磷、有机氯等四大类农药的转解毒酶基因工程菌。将抗性库蚊解毒酶酯酶B1基因片段引入融合表达载体pThioHisA中,转化入大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下,经过8 h,酯酶B1在大肠杆菌中的获得融合高效表达。研究了工程菌的酶酯活性,重组质粒pThioHisA-B1表达的酯酶融合蛋白具有较高的酯酶B1活性,能高效降解酯酶的特异性底物α-乙酸萘酯(-αNA)和β-乙酸萘酯(-βNA),该工程菌将为农药污染的生物治理提供新手段。