PCR—ELISA检测HBV DNA的研究

目的：建立一种敏感、特异的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测方法。方法：应用PCR扩增技术和核酸杂交技术结合酶促显色技术（即PCR－ELISA技术）来检测血清中的HBV DNA。结果：应用PCR－ELISA技术能够检出许多PCR琼脂张胶电泳所检测不到的HBV DNA,大大地提高了检出率,而且,特异性强。结论：PCR－ELISA方法灵敏度高,行异性强,检测结果数据化,不受主观因素的影响。     

肝病患者肝细胞内HBV DNA原位杂交研究——形态、分布及意义

应用生物素标记HBV DNA(乙肝病毒脱氧核糖核酸)作探针,对129例肝病患者肝组织作原位杂交研究。发现HBV DNA主要存在肝细胞浆内,可分为胞浆致密型、疏松型和包涵体型。HBV DNA阳性肝细胞在肝实质中分为三种型:小叶型、局灶型与散在点状分布。HBV DNA在慢性活动型肝炎中检出率最高(81％),显著高于肝硬化,慢性小叶型肝炎、急性肝炎及原发性肝癌组。乙肝复制指标阳性患者肝细胞内HBV DNA检出率明显高于非复制组;并观察到HBV DNA阳性肝细胞与肝细胞坏死灶关系密切,多数紧紧毗邻肝细胞坏死灶/或和位于坏死灶中间,尤以局灶型分布的HBV DNA阳性肝细胞为显著。     

HBV—DNA的生物素寡聚核苷酸探针快速检测

本文建立一种快速ＨＢＶ－ＤＮＡ检测方法,此法是基于生物素标记的寡聚核苷酸与硝酸纤维素滤膜上的靶ＤＮＡ杂交,然后通过Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ－碱性磷酸酶偶联体及生色底物进行检测。本文研究了此法的实用性,表明对于实验室及临床的ＨＢＶ－ＤＮＡ检测,此法是一种快速（４小时）、灵敏（１－１０ｐｇ）、特异、方便的方法。     

不同方法检测血清HBV DNA水平的比较

目的:研究不同方法检测血清HBVDNA水平的比较.方法:采用151份标本分别采用COBAS Amplicor、实时定量PCR(LightCycler及Mx3000p)方法进行平行检测.结果:①检测灵敏度:COBAS Amplicor方法灵敏度高于实时PCR方法(P=0.005、0.014),而Mx3000p灵敏度高于LightCycler方法(P=0.042).②相关性:实时定量PCR(LightCycler及Mx3000p)与COBAS Amplicor方法所测HBV DNA结果均呈线性相关(r=0.842,P＜0.01;r=0.946,P＜0.01).结论:实时定量PCR方法是较为经济且准确的HBV DNA检测方法,而Mx3000p在准确性和灵敏度上可能优于LightCycler方法.     

特异性DNA倍增技术(PCR)及其应用

特异性DNA倍增技术(PCR)是近年来发展的一种新技术,具有快速、简便、灵敏、特异性高和重复性好等优点,尤其适合于临床分子生物学检测。PCR技术包括三个循环过程:(1)模板DNA的变性,(2)模板DNA-引物的复性,(3)DNA聚合酶作用下的引物链的延伸。本文对耐高温Taq DNA聚合酶、PCR的反应体系、PCR产物特异性的影响因素和PCR技术的应用等几个方面进行了综述。     

用于扩增较大片段DNA的PCR方法

用于扩增较大片段ＤＮＡ的ＰＣＲ方法方向东,陈淳（中科院上海生物化学研究所国家分子生物学实验室,上海２０００３１）诸江（上海第二医科大学上海血液学研究所,上海２０００２５）关键词ＤＮＡ扩增,ＰＣＲ自从Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡ聚合...     

双退火温度PCR扩增DNA

【目的】与设置单一退火温度的常规PCR(S-T_m PCR)不同,本研究探讨双退火温度PCR(D-T_m PCR)由高到低设置2条引物各自退火温度。【方法】以PxF61和VPel为正/反向引物,用Q5 DNA聚合酶扩增4.3 kb的模式DNA pET20b-Xyn(黑曲霉木聚糖酶基因)。PCR程序为:98°C预变性3 min,30次循环{98°C变性30 s,设置双退火[T_(m1) 70°C(Px F61)退火15 s、T_(m2) 62°C(VPel)退火15 s],72°C延伸130 s}。【结果】与S-T_m PCR(61°C)相比,D-T_m PCR扩增4.3 kb的目的条带亮度更高,减少2条杂带;经25次循环目的 DNA产物量最高。D-T_m PCR用于长片段引物扩增5.3 kb重组质粒DNA条带更明显。【结论】D-T_m PCR直接扩增目的条带,避免了探讨T_m的麻烦,不要求2条引物T_m相近,从理论上更加清晰地认识引物与各自模板分步退火过程。     

液相杂交快速检测特异DNA

检测特异DNA片段的方法中,传统Southern blot技术由于其高度可重复性及能够显示条带大小的特性,一直是DNA检测的“黄金标准”.但是杂交时间长,步骤复杂,放射性污染等问题亟待解决.为了简化Southern blot,研究使用了一种液相杂交快速检测DNA的方法,即使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的dUTP掺入探针后,在溶液中与待检测DNA样本42℃下杂交,然后琼脂糖凝胶电泳检测荧光杂交信号.利用质粒为模板,优化了探针制作、杂交液组成、杂交时间和温度等参数.在FITC-dUTP∶ dTTP比例为1∶3、模板质粒浓度为50μg、1×杂交缓冲液(25 mmol/LTris,10mmol/L EDTA,8mmol/L Nacl,PH =8.0)中95℃变性5～9 min和42℃杂交3h的实验条件下,可检出1.2μg的质粒,探针灵敏度为7.3 ng/μl.这种方法不需要转膜,曝光,大大节约了时间,简化了操作,荧光检测也为该方法同时检测多色样本提供了可能,可广泛应用于核酸检测.     

乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的同步PCR扩增

介绍了一种从人血清中同步扩增和检测ＨＢＶ－ＤＮＡ和ＨＣＶ－ＲＮＡ的方法。ＨＣＶ－ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,这种ｃＤＮＡ和从ＨＢＶ中抽提出的ＤＮＡ一起,用根据ＨＢＶ、ＨＣＶ保守区序列设计的特异引物进行同步ＰＣＲ扩增,这种方法对于检测ＨＢＶ和ＨＣＶ重复感染很有用处     

Integration of HBV-DNA into liver and hepatocellular carcinoma cells during persistent HBV infection

The hepatitis B virus carrier state (persistent HBV infection) is characterized by the presence of viral surface antigen (HBsAg) and virion particles (Dane particles) in the blood. From 1% to 10% of carriers develop chronic liver disease and/or hepatocellular carcinoma. Recent studies have demonstrated integrated HBV-DNA in hepatocellular carcinomas and in several human hepatoma cell lines. In hepatoma patients, integrated HBV-DNA has been found in all HBsAg carriers. Nontumorous liver also revealed integrated HBV-DNA with the same or a different hybridization pattern from that observed in the tumor. To explore when integration occurs, carriers of short-term (less than 2 years) or long-term (greater than 8-10 years) were evaluated. DNA extracts from percutaneous (needle) liver biopsies showed free viral DNA with no specific integration bands in short-term carriers. In long-term carriers, HBV-DNA was integrated into the host genome with either a diffuse or a unique hybridization pattern. HBV-DNA integration correlated with the duration of the carrier state and absence of virions in the serum but did not correlate with histologic evidence of chronic hepatitis. These studies suggest that integration of HBV-DNA occurs during persistent HBV infection irrespective of liver disease and precedes development of hepatocellular carcinoma.     

简单、快速、高效扩增和标记目的基因技术的研究

从固体平板挑取转化带有目的基因的单菌落 ,用特异引物通过聚合酶链式反应可直接扩增和标记目的基因 ,不需经过菌的液体培养、质粒提取和酶解反应等复杂过程 ,能快速获得目的基因扩增产物和进行目的基因探针的标记。     

Detection and identification of Vibrio parahaemolyticus by multiplex PCR and DNA-DNA hybridization on a microarray

In this paper,we developed a rapid and accurate method for the detection of Vibrio parahaemolyticus strains,using multiplex PCR and DNA-DNA hybridization.Multiplex PCR was used to simultaneously amplify three diagnostic genes(tlh,tdh and fia)that serve as molecular markers of V.parahaemolyticus.Biotinylated PCR products were hybridized to primers immobilized on a microarray,and detected by chemiluminesce with avidin-conjugated alkaline phosphatase.With this method,forty-five samples were tested.Eight known virulent strains (tlh+/tdh+/fia+)and four known avirulent strains(tlh+/tdh-/fla+)of the V.parahaemolyttcus were successtuny aetectea,ana no non-spectnc hybridization and cross-hybridization reaction were found from fifteen closely-related strains(tin-/tdh-/fta+)or the Vibrio spp.In addition,all the other eighteen strains of non-Vibrio bacteria(tlh-/tdh-/fla-)gave negative results.The DNA microarray successfully distinguished V.parahaemolyticus from other Vibrio spp.The results demonstrated that this was an efficient and robust method for identifying virulent strains of V.parahaemolyticus.     

PCR和Southern Blot检测土拉弗氏菌气溶胶

为提高检测土拉弗氏菌的特异性和敏感性,建立了土拉菌ＰＣＲ及核酸杂交检测方法。运用平板计数、多聚酶链反应对土拉菌气溶胶稳定性进行了比较,结果表明ＰＣＲ具有较高灵敏度,并且在采样后３小时ＰＣＲ就可以得出定性结果,而平板计数则需要３～７天。采用ＰＣＲ法合成了土拉菌３７６－ｂｐ探针,分别对细菌菌液、５６８－ｂｐＰＣＲ产物和气溶胶样品进行杂交,结果表明菌悬液直接杂交可检出１０５ＣＦＵ左右的细菌,检测ＰＣＲ产物可达４０ｐｇ。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹相结合有利于细菌的分离鉴定     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。     

四引物PCR扩增反应的单管SNP快速测定法

建立一种在单管中进行单核苷酸多型性 (SNP)快速测定的高效廉价方法 .以人ABCA1基因中的I82 3M为研究对象 ,设计 4种引物进行PCR扩增 ,其中两种引物用于扩增一段含有SNP位点的DNA片段 ,另两种引物为SNP位点特异性引物 ,4种引物在单管中同时进行PCR扩增反应 ,根据延伸产物的长度确定SNP的类型 .为提高SNP测定的特异性 ,在特异性引物的 3′端倒数第 3个碱基引入了一个人为错配碱基 ,使引物的错误延伸率显著降低 ,大大提高了SNP分析的准确性 .实验结果表明 ,所建立的方法简单 ,操作简便 ,可在单管中完成SNP的测定反应 .