牛病毒性腹泻病毒Erns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的:利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定.方法:用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用(G4-S)3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-E(MS)-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白.并对表达产物进行鉴定.结果:SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76 800;Westem blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力.结论:BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测.     

牛病毒性腹泻病毒E^rns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的：利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定。方法：用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用（G4-S）3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-Erns-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白,并对表达产物进行鉴定。结果：SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76800;Western blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力。结论：BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测。     

抗病毒噬菌体抗体库研究进展

噬菌体抗体库技术是基于噬菌体表面展示技术发展起来的一项基因抗体工程新技术.它将含亿万种基因的抗体可变区基因库转化成展示在噬菌体表面的蛋白库,不仅使对于具备所需属性的单克隆抗体筛选能更方便、快速、高效地在体外进行,还开辟了单克隆抗体人源化的新途径,揭开了人类单克隆抗体生产的历史新篇章.本文综述了近年来针对各种病毒的噬菌体抗体库的构建、筛选方法以及其在各种病毒性疾病研究中的最新进展.     

噬菌体抗体库技术研究进展

抗体研究可分多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段。特别是噬菌体抗体库 (ｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙ)技术[1 ]可达到不经免疫制备人源性小型化基因工程抗体。这一技术将抗体基因的克隆与表达融为一体 ,是一种新的基因操作技术 ;同时将识别抗原与再扩增能力结合在一起 ,是一种高效的表达和筛选抗体的新一代技术。1　噬菌体抗体库技术的基本原理[2 ,3 ]噬菌体抗体库技术是将抗体ＶＨ和ＶＬ基因与噬菌体的外壳蛋白Ⅲ (ｃｐⅢ )或Ⅷ (ｃｐⅧ )基因随机重组 ,继而感染大肠杆菌 ,经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Ｆａｂ…     

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ, GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示, VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD; Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1:10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中, VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛...     

噬菌体抗体库技术制备高亲和力人抗体

噬菌体抗体库技术的基本原理是将全套抗体可变区基因组装到丝状噬菌体表达载体内 ,与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ基因融合并表达到噬菌体表面 ,以固相化的抗原作配基 ,通过吸附 洗脱 扩增的富集过程 ,筛选到与抗原特异结合的抗体克隆 ,并得到相应的抗体可变区基因。因此噬菌体抗体库技术可以被认为是体内抗体生成过程的模拟 ,首先建立足够多样性的抗体库 ,然后通过免疫亲和筛选即可能得到针对任何抗原的人抗体。该技术省时省力 ,无...     

在大肠杆菌中分别表达汉滩病毒素膜糖蛋白G1和G2

利用PCR方法扩增了汉滩病毒76－118株囊膜糖蛋白G1和G2的编码区基因,并将PCR产物克隆到T-载体中,用限制性内切酶将G1和G2的编码区基因切下,并克隆到表达载体pBV220中构建G1和G2的表达质粒。诱导表达后在SDS－PAGE凝胶中未见表达产物带,表达的G1和G2能与部分抗G1和G2的单克隆抗体发生反应,但用Western－blot方法不能检测到表达产物。用表达的G1和G2免疫小白鼠能刺激小白鼠产生特异性抗汉摊病毒的抗体,间接免疫荧光抗体的滴度可分别达到1:160和1：320。     

表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗,首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pVI75转移质粒,并将HIV-I中国主要流行株B'/C重组株CN54 gagpol基因置于pVI75的启动子pE/L下,构建重组质粒pVI75-Gagpol.重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞.前三轮通过G418加压,噬斑纯化,得到既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒;后三轮在无G418选择压力下,筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的白色重组痘苗病毒.结果表明筛选到了一株重组病毒,经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因已丢失;PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中;抗体染色和Western blot结果证实该重组病毒能很好地表达目的蛋白.     

应用原位放射免疫技术检测目的基因克隆

遗传工程技术促进了基因结构和功能的分 析、生产具有经济效益的蛋白质的研究。在获 得大量的基因重组克隆中,如何检测和筛选出 含有目的基因的克隆,是遗传工程的重要技术 之一。目前常用的方法是利用DNA-DNA或 RNA-DNA杂交的基因探针检测目的基因, 但它必须获得特异的基因。在缺乏特异的基因 探针时,近几年来建立了免疫探针检测筛选 法[2-61,它是将目的基因编码的多肤抗原制备成 抗体,直接从基因克隆库中筛选能表达目的基 因的克隆。     

H3N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得H3N2亚型禽流感病毒核蛋白(NP)全长基因,并在大肠杆菌中表达,以用于对NP功能的研究。方法:从感染了H3N2亚型禽流感病毒的MDCK细胞培养液中收获病毒,提取病毒RNA,用RT-PCR扩增出NP基因的编码区序列,将其定向克隆到pTIG-TRX原核表达载体并测序,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。结果:所克隆的核苷酸片段包含了NP基因编码区完整阅读框架,编码498个氨基酸;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达出相对分子质量约66000的重组蛋白。结论:克隆和表达了禽流感病毒核蛋白编码区基因,为获得大量NP以制备抗体,以及对其进行功能性研究奠定了基础。     

神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.     

以neo作选择标记富集和筛选阳性重组杆状病毒

将苜蓿银纹夜蛾(AcNPV)极早期基因IEI启动子控制的neo基因表达盒插入p10型转载体pAcEP106中得到pAcPIneo,将它和野生型AcNPV DNA共转染Sf细胞得到neo^+重组病毒.因为neo基因的表达使得neo^+基因的重组病毒可以在G418的存在下复制,而野生型则不能.将共转染得到的上清液以很低的感染复数连续传代,通过G418的选择作用,使重组病毒得到富集,三代以后重组病毒比例可达90%以上,如此之高的重组比例使得重组病毒的筛选不须经空斑纯化只须有限稀释即可得到.利用杆状病毒早期基因启动子表达neo基因为用早期基因表达外源毒素基因作重组病毒杀虫剂打下了基础,同时也建立了一种简便有效的筛选、富集阳性重组病毒的方法.     

猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

本研究扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1-756 bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得vp4基因的表达,对表达的VP4蛋白进行Western blot分析和血清中和抗体试验.结果表明JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株CRW-8株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96.43%和67%,说明JL94株与CRW-8株属同一VP4血清型,而与Gottfried株属不同血清型.JL94株VP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于aa81-aa207.vp4基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的20%,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性.所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变.     

大熊猫犬瘟热病毒H基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

本研究参照GenBank上已公布的大熊猫犬瘟热病毒(CDV)H编码的基因序列,对其抗原保守结构和识别区域进行修饰,将CDV保护性抗原H基因克隆到pMDTK-pEL载体中,然后运用酶切、连接将表达盒PELH构建到pTK-Eg载体中,从而获得重组转移载体质粒pTK-H-Eg。将重组转移载体质粒pTK-H-Eg与GTPV AV41株共转染BHK细胞,使其在细胞内发生同源重组,获得重组CDV的H基因的山羊痘病毒,然后在Vero细胞上加压筛选,利用gpt培养基筛选到稳定表达EGFP的重组病毒。通过PCR、免疫荧光以及Western Blot鉴定,证明CDV H基因成功构建到GTPV基因组中,并且在细胞中获得了正确表达。本研究获得了表达CDV H基因重组山羊痘病毒,并命名为vpTK-H-Eg。     

胞内抗体技术及医学应用

胞内抗体技术是近年来随抗体工程技术发展起来的一项新型基因治疗方法．它将单链抗体表达于非淋巴细胞内,并使之定向分布于细胞核、细胞浆或内质网等部位,特异性阻断、干扰分布于该部位的大分子物质生物活性或加工分泌过程．实验证明该技术能抑制生长因子受体的表达,灭活原癌基因蛋白,抑制病毒复制．在生物科学及医学研究中具有很大应用潜力．     

棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备

昆虫杆状病毒和痘病毒是目前已知唯一编码泛素基因的病毒.通过PCR方法,克隆了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素基因(Ubiquitin,Ubi).序列分析表明,该基因编码区全长252bp,编码83个氨基酸残基,预计分子量为9.24kDa.将泛素基因克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组质粒pET-Ubi,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合蛋白.用His-tag抗体检测目的蛋白,Westen-blot实验证明所表达的蛋白是带有His-tag的重组融合蛋白.通过改变IPTG浓度和诱导时间对表达条件进行了优化.利用NI-琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定为单一条带,同时用提纯蛋白制备了特异性抗体,为进一步的研究打下基础.     

人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选

从分泌抗癌胚抗原(carcinoembryoni antigen, CEA)单抗的杂交瘤细胞株C50中提取总RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增分别得到抗体轻、重链可变区基因, 再利用两对PCR引物合成和扩增得到全单链抗体基因. 将含轻、重链可变区序列的DNA片段克隆于含噬菌体基因Ⅲ的噬菌粒pCANTAB5. 重组克隆在噬菌体表面表达基因Ⅲ与单链抗体的融合蛋白. 表达具抗原结合活性的单链抗体的重组噬菌体可以通过亲和筛选的方法筛选得到并富集. 利用该方法我们可以从许多分泌不同抗体的杂交瘤细胞RNA中快速克隆和筛选功能性抗体可变区基因.     

基因工程疫苗的病毒载体

病毒基因工程疫苗是以活病毒为载体将一段外源基因导入机体细胞内,并使外源基因维持较高水平的表达。通过使用复制型或复制缺陷型载体能使表达的抗原诱生机体产生相应的体液抗体,并能引起机体产生细胞介导的免疫反应及粘膜免疫反应。本文主要介绍有可能用于基因工程疫苗的DNA及RNA病毒载体构建及其应用。     

阻档HIV扩散的细胞

法国科学家对人类细胞进行改造,使之一旦受艾滋病病毒(HIV)感染即自行崩解。他们设计了一种自杀基因,并将其插入到一群被HIV感染的CD4细胞中,并使之能被HIV感染所激活。然后,他们尝试对这一群细胞进行离体再侵染。结果说明这一方法已阻挡了艾滋病病毒的离体扩散。由此,不少制药公司已明显对这项研究感兴趣。这种自杀基因为HSV1-TK,编码单纯疱疹病毒(1型)胸苷激酶。该基因经电激法插入到CD4淋巴细胞中,处于HIV启动子调控之下。出现HIV感染时,HSV1-TK表达量非常高。向培养基中添加     

日本血吸虫未成熟卯单链抗体库的构建、筛选及初步应用

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原（SIEA）单链抗体（scFv）表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体．并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26-28ku特异性scFv大量表达．随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA2628ku天然分子候选疫苗相关的编码基因．结果显示,所获得的SIEA26-28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4．SIEA26-28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26-28ku的编码基因奠定了基础．