产肠毒素大肠杆菌的热敏肠毒素B亚基(LT-B)和耐热肠毒素(ST)基因融合及其表达

采用基因重组技术构建了表达产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素(ST)基因和热敏肠毒素B亚基(LT-B)基因融合抗原的疫苗候选株。将ST基因的5’端与LT-B基因的3’端连接,并置于同一阅读框。编码ST的基因是通过PCR从pSLM004质粒中扩增得到的,含有ST的pro序列(其编码ST前体的pro区域),并应用寡核苷酸定点突变技术将编码ST的第14位氨基酸残基发生突变,使ST的第14位氨基酸残基Ala突变为Leu。在所构建的结构中,于LT-B和proST之间分别插入了不同长度的氨基酸Linkers。表达的融合多肽同时具有ST和LT-B的抗原性,并保留结合GM-1神经节苷脂的能力,且无LT和ST的生物毒性。表达的融合蛋白免疫动物,能诱导产生相应的特异性抗体。     

大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及其纯化保存策略

编码完整大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的基因被引入pET11c形成pET11-LT,该质粒在E.coli BL21(DE3)中得到较高效率的表达,约46mg/L。用D(+)Immobilized galactose柱可以在很宽的pH范围(pH7.3～10.4)内用多种方法对LT进行纯化且保持其结构完整。溶于TEAN(pH7.3)或碳酸盐缓冲液(pH10.4)的LT,冻干后保存于4℃,可长久保持其完整结构,此为保存LT的较好策略。与GM1结合实验、CHO细胞及Patentmouse毒性检测实验证明纯化的LT具有生物学活性。     

大肠杆菌产生不耐热肠毒素的影响因素

为了探讨大肠杆菌产生肠毒素的影响因素,近年来,我们从霍乱样腹泻病人粪便中分离的优势菌,经多次兔肠结扎试验,证实大肠杆菌7910、7914、7915、7922、7926、432、447、7927、7929、7930、7931、7948等12株能产生不耐热肠毒素,该菌株接种于pH7.6、3%(月示)胨水中,置37℃孵育4天。每一影响因素的每次测定均在同一家兔小肠结扎段中进行,兔肠结扎试验方法见文献。1.培养时间对产生肠毒素的影响:我们对     

肠毒原性大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)基因探针的研制

经氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心分离纯化重组质粒pMMO 30 DNA 琼脂糖凝肢电泳回收的1．TDNA—HindII片段,用DNA缺口转译技术制备a-32p标记的LT基因探针,与标准ETFC(LT+)杂交为阳性,与非ETEC杂交则无同源性。从腹泻儿童和腹泻病猪粪便中分离的、经兔肠段结扎试验和免疫沉淀测定LT呈阳性的EFEC,与基因探针杂交呈现阳性：而且一个单菌落在硝酸纤维素滤膜上裂解的DNA印迹,与探针杂交可以进行放射自显影。如果采用不同的杂交条件,还可以鉴删测定ETEC的LT基因和霍乱弧菌的CT基因,一次可以进行几百个菌落的测定。结果表明,该探针可以用于实验室诊断和流行病学调查。     

猪大肠杆菌耐热肠毒素和热敏肠毒素基因的融合及表达

用聚合酶链反应扩增出猪源大肠杆菌编码ST前体（proST）和LT的B亚单位(LTB)成熟多肽的序列,再通过套式PCR将proST编码序列3′端和LTB编码序列5′端融合,并置于同一阅读框内,得到ST和LTB的融合基因,将此序列克隆到pGEMT质粒中,序列分析后,亚克隆到表达载体pQE30中,在大肠杆菌细胞中得到表达,表达的融合蛋白同时具有ST和LTB的抗原性,且无ST和LT的生物毒性。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b—LTB表达载体、转化大肠杆菌B121（DE3）进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS—PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。     

应用被动免疫溶血试验快速检测大肠杆菌不耐热肠毒素

本文介绍了被动免疫溶血试验检测埃希氏大肠杆菌不耐热肠毒素的方法;比较了四种不同培养基以及抗CT血清和抗LT血清对测定结果的影响。经对236株人源和24株猪源毒素源性大肠杆菌的测定结果表明,该方法与固相放射免疫分析、LT基因探针等方法的测定结果基本相符。说明被动溶血试验是一种快速、敏感和特异的检测方法,不仅可用于流行病学调查,在临床检验上也是一种可行手段。     

双加氧酶α亚基保守序列克隆及探针制备

制备地高辛标记的环羟基化双加氧酶的α亚基保守序列探针。利用PCR法成功地克隆了环羟基化双加氧酶的α亚基保守序列310 bp片段,并对其进行测序。利用PCR法制备地高辛标记探针,对新标记的探针进行检测,结果显示其标记效率在0.1 pg/μL;敏感性检测表明,对同源DNA的检出限量为100 pg;对提取的副溶血性孤菌质粒DNA、短小芽胞杆菌总DNA杂交均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。     

人产毒性大肠杆菌产生的不耐热肠毒素的亚型

<正> 本文对纯化的产毒性大肠杆菌240-3株产生的不耐垫肠毒素B亚单位的氨基酸组成及序列进行了分析,并将结果与yamamoto,T,yokota,TLeong,J,vinal,A·C,Dallas,M、S的报道进行了比较。他们分别从人株H10407和TB103的DNA序列数据中推断出不耐热肠毒素的氨基酸序列。 按以前描述的方法制备粗捉毒素。将纯化的大肠杆菌240-3不耐热肠毒素[LTh(240-3)]B亚单位羧甲基化,琥珀酰基化,凝乳胰酶消化,最后经高压液相色谱处理。随后分析了肽峰的氨基酸组成并与yamamoto和leong等报道的资料进行比较,     

霍乱肠毒素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

霍乱弧菌569B染色体DNA,经毒源性大肠杆菌不耐热毒素基因探针定位,确定霍乱毒素基因分别位于EcoRI/pst I 酶解的5.1和5.4kb片段。我们分离其EcoR I/Pst I 酶解的4.5—6．0kb片段,与经EcoR I／Pst I 酶解的质粒pBR322体外连接转化大肠杆菌,经原位菌落杂交及重组质粒DNA的电泳分析鉴定,获得了霍乱毒素基因的克隆。通过生物活性和抗原性测定,表明霍乱毒素基因在大肠杆菌中获得了表达。     

产肠毒素大肠杆菌的热敏肠毒素B亚基（LT—B）和耐热肠毒素（ST）基？…

采用基因重组技术构建了表达产肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的耐热肠毒素（ＳＴ）基因和热敏肠毒素Ｂ亚基（ＬＴ－Ｂ０基因融合抗原的疫苗候选株。将ＳＴ基因的５‘端与ＬＴ－Ｂ基因的３’端连接,并置于同一阅读框。编码ＳＴ的基因是通过ＰＣＲ从ｐＳＬＭ００４质粒中扩增得到的,含有ＳＴ的ｐｒｏ序列,并应用寡核苷酸定点突变技术将编码ＳＴ的第１４位氨基酸残基发生突变,使ＳＴ的第１４位氨基酸残基Ａｌａ突变为Ｌｅｕ。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。     

大肠杆菌耐热肠毒素在细菌表面的呈现

为了探讨CS3菌毛呈现载体用于呈现立体表位的可行性,选择大肠杆菌耐热肠毒素（ST）作为靶蛋白,通过全细胞ELISA,电镜技术来检测重组蛋白的表达,结果显示重组蛋白以杂合菌毛的形式得到了表达,并保持有CS3载体蛋白的抗原性,初步表明ST在细菌表面得到呈现,CS3菌毛呈现载体可用于立体表位的呈现。     

大肠杆菌耐热肠毒素产毒条件的研究

产生耐热肠毒素是致病性大肠杆菌的重要特征之一。乳鼠灌胃试验(IMGT)虽是鉴定致病性大肠杆菌的有效方法,但只有掌握好耐热肠毒素(ST)的产毒条件,才能充分发挥该试验的效能。因此,筛选适宜的产毒条件,在人畜大     

大肠杆菌不耐热毒素B亚单位与ST肠毒素的融合

<正> ST基因编码的遗传信息在结构上已被确认是一个20个氨基酸的引导区连接一个功能不详的34个氨基酸和一个可活化胞外毒素的18个氨基酸。这个遗传信息足以使ST肠毒素释放于细胞之外。不耐热肠毒素之LTB亚单位通常存在于宿主菌的周质内,为了驱使LTB亚单位排出胞外及对上述的34个氨基酸之作用进行研究,我们组建了一个ST与LTB亚单位的杂种DNA分子。LTB亚单位之调节因子已被除去而这一融合分子是由除掉转录及转译终止子的ST基因之三个原羟端区和除掉Shine-Delgarno box序     

大肠杆菌肠毒素的基因融合及其免疫原性的研究

应用重组基因工程技术,将热敏肠毒素Ｂ亚基（ＬＴ－Ｂ）基因与含有部分前体的耐热肠毒素（ｐｒｏ－ＳＴ）基因融合在一起,构建了表达ＬＴ－Ｂ／ｐｒｏ－ＳＴ融合蛋白的重组质粒．该融合蛋白不仅保持结合神经节苷脂（ＧＭ１）的能力,而且具有热敏肠毒素和耐热肠毒素的抗原性．乳鼠实验证明,融合蛋白虽然含有野生耐热肠毒素,但不具耐热肠毒素的生物毒性．腹腔免疫和鼻饲免疫均能激发产生抗ＥＴＥＣ两种肠毒素的抗体．     

耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR法从水生栖热菌菌株YT－1中扩增耐热DNA聚合酶基因,得到2．5kb的DNA片段t扩增片段重组到pUCl8中测序证实为Taq DNA聚合酶基因,将该片段重组到pBV221温控表达质粒中,在大肠杆菌中表达出94kDa的重组蛋白,100ml培养物的细胞产酶为1．5×10⁵u,表达的蛋白能催化PCR反应的进行。