江苏泰州地区HIV感染人群的血浆病毒群落研究

为探讨人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染人群血浆病毒群落组成,分析HIV感染人群血浆病毒群落的特点,研究病毒载量对HIV感染人群血浆病毒群落的影响,本研究通过Miseq高通量测序,对江苏泰州地区203份HIV感染人群的血浆样本进行了病毒宏基因组学分析。结果显示,高通量测序共得到243824条注释为病毒的序列,可注释到至少17个不同的病毒科(包括未分类病毒),包括12种哺乳动物类病毒(占99.87%),2种昆虫病毒(占0.05%),1种植物病毒(占不到0.01%),2种其他病毒(占0.02%)及未分类病毒;检出HIV病毒载量组的病毒群落中占据主导地位的是细小病毒科,其次是黄病毒科和指环病毒科,未检出病毒载量组中的主要病毒为黄病毒科,其次为指环病毒科和细小病毒科;系统进化分析显示,注释为细小病毒的序列与已知病毒的同源性较高,而注释为指环病毒和人佩吉病毒的序列中有部分序列与已知病毒同源性较高,另有部分序列与已知病毒的差异较大,疑似有新型病毒的存在;应用PCR扩增对部分病毒序列进行验证,将验证后的部分序列与原始序列进行比对,一致性达到近99%。     

牛泡沫病毒（BSV）对牛免疫缺陷病毒（BIV）的激活作用

用瞬时表达分析等方法,证明牛泡沫病毒（ Ｂ Ｓ Ｖ）３０２６ 中国毒株能在体外激活牛免疫缺陷病毒（ Ｂ Ｉ Ｖ） 基因表达, Ｂ Ｓ Ｖ３０２６ 编码的反式激活因子 Ｂｏｒｆ１ 行使这种激活作用。缺失突变分析表明, Ｂｏｒｆ１ 在 Ｂ Ｉ Ｖ Ｌ Ｔ Ｒ 上靶序列位于－ ４１０／ － １１５（ ＋ １ 为转录起始位点） 区域,但其中的 Ｎ Ｆκ Ｂ 位点（ － ３６７／ － ３１９） 与这种激活作用无关,包括转录起点下游（ Ｒ Ｕ５ 区） 在内的－ １１５／ ＋ ２０４ 区域也与这种激活作用无关。该结果对研究 Ｂ Ｉ Ｖ 致病机理及防治 Ａ Ｉ Ｄ Ｓ 有重要意义。     

斜纹夜蛾多角体病毒包埋型病毒受体的鉴定

蔗糖密度梯度离心法提纯斜纹夜蛾核多角体病毒（＄Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｌｉｔｕｒａ　　ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｄｒｏｖｉｒｕｓ,　ＳｐｌｔＭＮＰＶ）包埋型病毒粒子（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖｉｒｕｓ,ＰＤＶ）,以此病毒粒子作抗原,免疫家兔获得抗血清;用ＳＤＳ裂解缓冲液提取斜纹夜蛾幼虫中肠组织细胞总蛋白。采用病毒铺覆蛋白印迹技术（ＶＯＰＢＡ）,利用抗ＰＶＤ抗血清对病毒受体进行检测,结果表明斜纹夜蛾中肠细胞总蛋白中４０ｋＤ、７３ｋＤ、８５ｋＤ的三种蛋白能够结合ＰＤＶ。     

斜纹夜蛾多角体病毒包埋型病毒受体的鉴定

蔗糖密度梯度离心法提纯斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nucleopolyhdrovirus,SpltMNPV)包埋型病毒粒子(polyhedra-denved virus,PDV),以此病毒粒子作抗原,免疫家兔获得抗血清;用SDS裂解缓冲液提取斜纹夜蛾幼虫中肠组织细胞总蛋白.采用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA),利用抗PVD抗血清对病毒受体进行检测,结果表明斜纹夜蛾中肠细胞总蛋白中40kD、73kD、85kD的三种蛋白能够结合PDV.     

狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法的建立

建立狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法,并进行评价和初步应用。针对狂犬病病毒L基因保守区域设计特异性引物、探针,建立PCR反应体系并评价检测体系的扩增效率、灵敏度、特异性和准确性等指标,灵敏度评价结果与现有巢式RT-PCR和基于N基因qRT-PCR检测方法相比较。结果显示本研究建立的基于L基因qRTPCR检测体系扩增效率高于90%;最小检测病毒滴度为2.7×10~(-3)FFU/mL,灵敏度高于基于N基因qRT-PCR和巢式RT-PCR 100倍;最小检测核酸拷贝数为100拷贝,建立了基于目的基因RNA标准品的标准曲线,可用于定量检测;对于我国的狂犬病病毒流行毒株检测范围较广,动物样本检测结果与金标准DFA检测结果相一致,准确性较高。本研究建立的狂犬病病毒qRT-PCR可用于狂犬病病毒实验室检测。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。     

低温常压等离子体提高MDBK细胞中IBRV病毒滴度的作用与机制研究

加强病毒的繁殖可以帮助MDBK细胞生产更多的IBRV病毒用于生产灭活病毒疫苗。已证明低温常压等离子体（Cold atmospheric plasma,CAP）是一种依靠活性氧来实现MDBK细胞中病毒显著增殖的物理方法,可有效增强病毒的传播,其中牛鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotrachieitis virus,IBRV）和牛肾细胞（Madin-Darby Bovine Kidney,MDBK）分别被用作模型所需病毒和细胞系。CAP被证明与病毒感染具有协同作用,可以在G2/M期阻止宿主细胞分裂增殖,降低细胞膜电位,增加细胞内钙离子水平并诱导细胞选择性自噬。通过检测免疫相关蛋白表达,CAP被证明可以抑制病毒触发的免疫原性信号传导。综上所述,我们证明了CAP触发了宿主资源对病毒繁殖的最大化,这有利于病毒疫苗的生产,并为在医疗和卫生领域应用CAP开辟了新的可能。     

猪塞内卡病毒病原学研究进展

2014年以来,巴西、美国、中国、泰国等多个国家相继暴发了塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）疫情,且流行范围呈扩大趋势,SVA逐渐成为研究和关注的热点。本文主要从SVA病毒蛋白结构功能、入侵机制、适应性免疫反应及免疫逃逸等方面对SVA相关病原学研究进行综述,以期为进一步开展猪SVA的致病机制研究以及疫苗研发提供帮助。     

禽流感病毒快速检测方法研究进展

禽流感病毒是人类致病性病毒,其变异性强、传播速度快、病亡率高,严重威胁了人民健康和国民经济。目前全球对禽流感疫情防控的前提和关键是早发现、早隔离、早诊断、早控制。因此研发敏感、快速、特异、能进行高通量样品检测的禽流感病毒检测技术,使人类能在更短时间内监测、检测禽流感病毒的病原感染情况,对禽流感的防控具有重要意义。本文对禽流感病毒快速检测技术研究进展进行简要介绍。     

大熊猫犬瘟热病毒H基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

本研究参照GenBank上已公布的大熊猫犬瘟热病毒(CDV)H编码的基因序列,对其抗原保守结构和识别区域进行修饰,将CDV保护性抗原H基因克隆到pMDTK-pEL载体中,然后运用酶切、连接将表达盒PELH构建到pTK-Eg载体中,从而获得重组转移载体质粒pTK-H-Eg。将重组转移载体质粒pTK-H-Eg与GTPV AV41株共转染BHK细胞,使其在细胞内发生同源重组,获得重组CDV的H基因的山羊痘病毒,然后在Vero细胞上加压筛选,利用gpt培养基筛选到稳定表达EGFP的重组病毒。通过PCR、免疫荧光以及Western Blot鉴定,证明CDV H基因成功构建到GTPV基因组中,并且在细胞中获得了正确表达。本研究获得了表达CDV H基因重组山羊痘病毒,并命名为vpTK-H-Eg。     

二温式多重PCR检测对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒的研究

正对虾白斑综合征(WSS)和桃拉病(TS)是两种严重危害当前对虾养殖业的对虾病毒性疾病。目前对虾病毒病的诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫学方法、分子杂交方法及PCR方法1-4等。其中PCR方法是这些方法中特异性最强、敏感最高的病原检测手段,在国外已被广泛应用于对虾病毒病的检测和诊断。多重PCR是一种特殊PCR形式,其最突出特点,即一次PCR反应,就可同时检测、鉴别出多种病原体,在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特优势和很高的实用价值5,6。本试验建立了二温式多重PCR同时检测鉴别WSSV和TSV的方法,并用该多重PCR方法对广西沿海地区对虾养殖业WSSV和TSV感染状况进行了初步调查。现将结果报告如下。       

CRISPR/Cas系统在病毒感染性疾病治疗中的应用进展

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associate)系统作为当下炙手可热的基因编辑技术,近几年在各方面取得了诸多进展,本文就CRISPR主要类型Cas蛋白的作用方式,CRISPR/Cas技术在病毒感染性疾病中的应用,作用机制,当下治疗方法进行讨论,着重对人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、单纯疱疹病毒I型（Herpes simplex virus-1,HSV-1）、EB病毒（Epstein-barr virus,EBV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）、人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）、人类嗜神经多瘤病毒JC(Polyoma JC virus,JCV)、非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）进行综述。     

探寻新型HCV同源病毒的自然宿主

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是一个世界性的公共卫生问题,该病毒感染后可引起急、慢性肝炎。由于HCV的宿主范围较窄,一直未找到合适的动物模型来研究该病毒的致病机制、免疫预防等,至今也无证据表明动物源的HCV同源病毒可能跨种传播给人类。最近,研究者在小型野生动物(如啮齿类动物、蝙蝠)和家养动物(如犬、马、牛)中相继发现了新型HCV同源病毒(HCV样病毒和GBV样病毒),这些病毒分别属于丙型肝炎病毒属(hepacivirus)或持续性G病毒属(pegivirus),研究这些病毒的基因组结构和生物学特征有助于HCV的起源及其致病机制和免疫等研究。本综述从HCV基本特征、相关病毒谈起,着重介绍新型HCV同源病毒,并探寻其自然宿主,进而讨论了人类重要病原之一HCV的起源问题。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和盖他病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

盖他病毒(Getah virus,GETV)可感染猪并引起和猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)相类似的临床表现,且两者可混合感染而难以区分。我国检测PRRSV和其他诸多病毒的多重PCR文献已比比皆是,但尚无同时检测PRRSV和GET V方法的报道。为此,作者根据GenBank中公布的PRRSV和GETV全基因序列,设计了两对分别扩增PRRSV ORF7基因和GETV Cap基因片段的引物,通过反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,首次建立了可同时检测PRRSV和GETV的双重RT-PCR方法。结果显示,该方法可以同时扩增出PRRSV 633 bp和GETV 316 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒等其他相关病毒扩增结果均为阴性。对GETV和PRRSV的cDNA最低检测量分别为2.48×10~(-4)ng和2.50×10~(-5)ng。用建立的双重RTPCR方法对河南15个地市92个猪场的136份临床疑似PRRS发病猪样品进行检测,共从58个猪场检出PRRSV单一阳性样品44份,阳性率为32.4%;GETV单一阳性样品7份,阳性率为5.15%;GETV和PRRSV混合感染样品8份,阳性率为5.88%。检测结果与单一RT-PCR结果吻合率达100%。该方法为GETV和PRRSV的快速检测、鉴别诊断和分子流行病学研究等提供了新的技术手段。     

基于GoPubMed对埃博拉病毒研究文献的数据分析

本研究对埃博拉病毒相关研究载文量的文献计量学分析,以期为埃博拉病毒研究提供文献的数据支持。埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)是撒哈拉以南的非洲地区高致病性人畜共患传染病,本文基于文献计量学的分析方法,以“Ebolavirus”为主题词检索文献,检索截止至2018年3月2日被PubMed数据库收录的埃博拉病毒(Ebolavirus)相关研究文献,在PubMed中检索到4 391篇文献为研究对象。统计学分析其埃博拉病毒相关研究文献的高频主题词及发表文献的年份、国家、城市和期刊的分布情况,了解埃博拉病毒研究的现状及其发展趋势。结果表明2013-2015年,PubMed数据库收录的埃博拉病毒相关研究的载文量呈逐年上升趋势,2015年至本文统计日的载文量呈现逐年下降。本研究在PubMed数据库检索到的4 391篇埃博拉病毒研究文献中,载文量最多的国家为美国,中国排第六,载文量较多的地区和城市则集中在北美和欧洲等西方发达国家,载文量较多的城市中,中国的北京排第八位。埃博拉病毒相关研究载文量较多的期刊是Journal of Virology(J Virol)。利用GoPubMed检索到的埃博拉病毒相关研究文献,可以从文献数据的角度显示出埃博拉病毒研究的现状和发展趋势。     

一株牛源阿卡斑病毒的分离鉴定

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)是能引起牛、绵羊、山羊流产、早产、新生胎儿畸形的虫媒性RNA病毒。为了解家畜虫媒病毒在我国西南边境地区的分布和流行情况,本研究对中缅边境西盟县的52份牛抗凝血和140份血清(牛70份、羊70份)中的蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、AKV等虫媒病毒进行检测与分离,通过ELISA及qRT-PCR方法检测病毒,通过核酸阳性抗凝血接种BHK细胞传代以分离病毒,通过设计特异性引物,扩增分离毒株S基因721bp片段及M基因816bp片段,通过克隆测序及中和试验以鉴定病毒,最终从38号牛的抗凝血中分离到一株AKV,TCID50为10-3.5/0.1mL,经比对,分离株S片段与日本KS-2/Mo/06毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为97.66%,M片段与中国DHL10M110毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为96.56%。本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到AKV,证实了西南边境存在AKV的流行,为AKV在我国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。     

抗发热伴血小板减少综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备和功能分析

为制备抗发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)结构蛋白的单克隆抗体,本研究用灭活纯化的SFTSV病毒颗粒免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得分别分泌抗糖蛋白单抗和核蛋白单抗的杂交瘤细胞株。用免疫荧光法和免疫沉淀方法对制备的单克隆抗体的抗原特异性进行鉴定,并初步进行单抗效价、中和活性及亲和力等功能分析。结果显示,通过细胞融合和克隆化,共筛选出13株稳定分泌抗糖蛋白(Glycoprotein,GP)单抗和7株稳定分泌抗核蛋白(Nucleoprotein,NP)单抗的杂交瘤细胞株。免疫荧光和免疫沉淀鉴定显示获得的单抗有良好的抗原特异性。抗GP单抗中6株针对Gn,7株针对Gc,大部分的间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)滴度在1 280~20 480之间,其中4株抗Gn单抗具有中和活性。获得的7株抗NP单抗均与NP特异性结合,IFA滴度范围在5 120~20 480,均无中和活性。此外,经非竞争ELISA检测的两株抗GP单抗(1C8和1G8)均有较高亲和力。本研究为SFTS诊断方法的发展及SFTSV致病机制研究奠定了基础。     

中国HIV-1 B亚型P55和嵌合的P55-V3病毒样颗粒候选疫苗免疫效果的研究

研究我国艾滋病病毒Ⅰ型（ＨＩＶ－１）病毒样颗粒（ＶＬＰ）候选疫苗的免疫原性,为疫苗进行灵长类实验提供实验依据。将ｇａｇ和ｇａｇ－Ｖ３ ＶＬＰ不同剂量（５０μｇ、１０μｇ、１μｇ）在有佐剂（氢氧化铝）和无佐剂条件下皮下免疫小鼠,然后眼眶采血,用ＥＬＩＳＡ法观察免疫鼠血清中抗体与剂量关系,以及中和抗体滴度和抗体ＩｇＧ亚型ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ的水平。同时取鼠脾淋巴细胞,体外抗原刺激后收取淋巴细胞分泌上清