从ATPase8-6基因研究杂交多倍体鱼线粒体母性遗传

异源四倍体鲫鲤是世界上首例人工培育的两性可育并形成群体的且能自然繁殖的四倍体鱼。本文采用质粒克隆测序法测定了红鲫、异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤的ATPase8和ATPase6基因全序列 ,结合鲤鱼、日本白鲫和斑马鱼的同源序列 ,对不同倍性水平鲤科鱼类的ATPase8和ATPase6基因进行了比较 ,分析了碱基组成、变异情况以及核苷酸和氨基酸序列差异。红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、日本白鲫、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤之间的序列差异为 0 0 % - 1 3 4 % ,它们与外群斑马鱼之间的序列差异为 2 7 9% -31 0 %。用MEGA软件中的MP法、ME法、NJ法和UPGMA法构建分子系统树 ,得到了相似的拓扑结构。结果分析表明 ,人工杂交多倍体异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤在线粒体ATPase8和ATPase6基因上具有严格的母性遗传特征。值得注意的是 ,异源四倍体鲫鲤经过 1 1代的繁育后 ,与其原始母本红鲫仍然保持了非常高的同源性 ,说明了新的异源四倍体基因库在线粒体ATPase8和ATPase6基因上拥有稳定的遗传特性。对不同倍性鲤科鱼类线粒体ATPase8和ATPase6基因的研究表明 ,ATPase8和ATPase6基因是杂交鱼后代遗传变异研究的一个很好的分子标记     

远缘杂交形成的二倍体鱼和多倍体鱼生殖细胞染色体研究

本文采用性腺染色体制片及组织学切片方法,系统地研究了不同发育时期的鲫鲤杂交第二代(F2) (2n=100)、异源四倍体鲫鲤(4n=200)、三倍体鲫鱼(3n=150))、雌核发育二倍体鲫鲤第二代(G2)(2n=100)及鲤鱼(Cypninus carpio L)(2n=100)(对照组)生殖细胞的染色体特征.研究结果表明,对照组中鲤鱼精原细胞染色体数与体细胞染色体数一致,为二倍体精原细胞(2n=100),而远缘杂交形成的二倍体鱼和多倍体鱼的生殖细胞中则观察到明显的染色体数加倍现象,其中,鲫鲤杂交第二代(F2)精巢生殖细胞染色体数加倍现象特别丰富,占检测的染色体分裂相的21.6%,为其产生不减半的二倍体配子提供了直接的细胞学证据,同时也说明远缘杂交是导致生殖细胞染色体数加倍的一个重要因素.该研究在探讨多倍体鱼的发生及鱼类遗传育种方面具有重要意义.     

抑制Ligase4或Xrcc6活性增强斑马鱼原始生殖细胞中DNA同源重组的效率

利用斑马鱼作为体内模型, 研究旨在提高斑马鱼原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)中同源重组(Homologous recombination, HR)的效率。首先, 将UAS:mRFP-nos1载体显微注射到Tg (kop:KalTA4) 转基因胚胎中标记转基因PGCs, 结果表明筛选PGCs特异表达mRFP的胚胎能够相对提高转基因的生殖系传递效率。随后建立了PGCs中HR效率的评估体系, 并且证明抑制DNA ligase IV(Lig4)和Xrcc6(曾用名Ku70)的活性不但在全胚胎水平, 而且在PGCs水平都能够显著提高HR的效率。研究表明Tg (kop:KalTA4) 转基因品系是开展HR介导的基因打靶的一个有效平台。       

抑制Ligase4或Xrcc6活性增强斑马鱼原始生殖细胞中DNA同源重组的效率（英文）

利用斑马鱼作为体内模型,研究旨在提高斑马鱼原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)中同源重组(Homologous recombination,HR)的效率。首先,将UAS:m RFP-nos1载体显微注射到Tg(kop:Kal TA4)转基因胚胎中标记转基因PGCs,结果表明筛选PGCs特异表达m RFP的胚胎能够相对提高转基因的生殖系传递效率。随后建立了PGCs中HR效率的评估体系,并且证明抑制DNA ligase IV(Lig4)和Xrcc6(曾用名Ku70)的活性不但在全胚胎水平,而且在PGCs水平都能够显著提高HR的效率。研究表明Tg(kop:Kal TA4)转基因品系是开展HR介导的基因打靶的一个有效平台。     

团头鲂nanos3基因的克隆鉴定

为了标记团头鲂(Megalobrama amblycephala)的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells, PGCs), 首次克隆并鉴定了团头鲂nanos3基因(mananos3)。mananos3全长1027 bp, 包括48 bp 5′UTR (5′untranslated Region), 490 bp 3′UTR和489 bp开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)。该基因编码162个氨基酸。通过序列比对发现Mananos3蛋白和其他物种Nanos蛋白一样, 存在一个保守的RNA结合功能域, 该功能域包含一个锌指基序(Motif)。系统发育树结果显示, Mananos3与鲤(Cyprinus carpio)的Nanos3最为相近。半定量和定量PCR结果表明, mananos3具有较高的母源表达, 并在胚胎发育早期高量表达, 而在1000细胞期之后表达量逐渐降低。在成体组织中, mananos3仅在卵巢中检测到表达。mananos3和斑马鱼(Danio rerio) nanos3 (zfnanos3)的3′UTR均可以介导绿色荧光蛋白特异标记团头鲂和斑马鱼胚胎发育早期的PGCs, 但是mananos3的3′UTR能够更特异地标记团头鲂的PGCs。通过比对mananos3和zfnanos3的3′UTR发现, mananos3 的3′UTR中有一个非经典的miR430识别位点(GCACTA)。通过对该位点的突变研究证实其有利于nanos3在非PGCs组织中的降解。综上所述, 团头鲂mananos3的3′UTR序列中的非经典miR430识别位点(GCACTA)可能与介导报告基因在PGCs中特异表达相关。     

人原始生殖细胞的特化和表观遗传重编程研究进展

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)起源于原肠胚阶段,是生殖细胞的前体细胞,由特定细胞经过一系列分子调控特化而成。PGCs完成特化后迁移进入生殖嵴,在迁移过程中存在一系列的表观遗传修饰的动态变化,包括DNA甲基化和组蛋白修饰等。PGCs迁移的后期会发生两性分化,迁入生殖嵴的PGCs影响原始性腺的发育。有关小鼠PGCs特化、迁移/增殖和两性分化等的机制已得到了广泛研究,而在人类中则由于伦理以及材料获取困难等因素还有待更深入的研究。该文综述了人原始生殖细胞(human PGCs,h PGCs)的特化机制、表观遗传调节在其特化和迁移过程中的作用以及h PGCs对性腺形成的影响。     

三倍体湘云鲫2号线粒体DNA含量与其不育的相关性研究

三倍体湘云鲫2号是通过倍间杂交产生的一种多倍体鱼(红鲫(♀)×异源四倍体鲫鲤(♂)),因其不育性状,具有重要的生产和科研价值。有研究表明线粒体在动物育性的分子调控机制中扮演了重要角色,但在鱼类中尚没有相关的研究报道。利用本实验室特有遗传背景清晰的实验鱼品系(三倍体湘云鲫2号、二倍体红鲫、异源四倍体鲫鲤和同源三倍体鲫),通过荧光定量PCR技术对比分析了它们性腺中线粒体DNA的拷贝数,发现三倍体湘云鲫2号雄性个体精巢中mt DNA含量较正常水平高,雌性个体卵巢中mt DNA含量较正常水平低。实验首次从线粒体DNA含量影响生殖细胞发育的角度探索线粒体与三倍体湘云鲫2号不育的关系,为三倍体湘云鲫2号不育分子机制的研究提供了一些新的基础数据。     

25-羟基胆甾醇对鸡原始生殖细胞增殖的影响

本研究为了优化现有的鸡PGCs(原始生殖细胞)的培养系统,为今后研究生殖细胞发育与生产转基因鸡奠定良好基础。分别用含0μmol/L(对照组)、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L 25-羟基胆甾醇的培养液培养鸡PGCs,5 d后细胞计数检测其细胞增殖情况。与对照组(不添加25-羟基胆甾醇的鸡PGCs培养液)相比,0.1μmol/L处理组细胞数目没有显著差异,0.5μmol/L和1μmol/L处理组细胞数目均显著增加。对1.0μmol/L 25-羟基胆甾醇处理的鸡PGCs用RT-PCR、细胞免疫染色、细胞注射迁移的方法检测处理后的生物学特性,发现处理后的鸡PGCs仍然保持正常的生殖细胞生物学特性。本研究表明25-羟基胆甾醇能有效的促进鸡P GCs的增殖,且不改变鸡PGCs的生物学特性。     

鲤鲫人工多倍体谱系中同工酶和蛋白的基因表达

通过对红鲤、红鲫、镜鲤、鲤鲫杂种二倍体一代,二代,鲤鲫杂种三倍体,鲤鲫复合三倍体,鲤鲫杂种四倍体一代,二代的同工酶及蛋白电泳谱型和扫描数据分析表明,在鲤鲫人工多倍体谱系中,亲代的等位基因在杂交子代中共有四种表达模式;（1）两亲本基因在子代中共同表达,即共显表达;（2）父本的基因表达受到部分或完全的抑制,即母本的基因优先得到表达;（3）母本的基因表达受到抑制,父本的基因得到表达;（4）双亲本的基因表达均受到一定程度的抑制或都不表达。其中第一种表达模式是主要的模式。根据以上基因在杂交子代中的表达特点,可用同工酶和蛋白电泳图谱将鲤鲫人工多倍体谱系的各种生物型逐一加以区分。     

异源四倍体鲫鲤及其原始父母本细胞周期蛋白B基因克隆与分子遗传分析

细胞周期蛋白(cyclin)B是真核细胞周期运转中调控G2期至M期转化的关键因子.本实验根据斑马鱼细胞周期蛋白 B1基因的剪切方式,设计3对特异于金鱼和银鲫细胞周期蛋白B基因外显子区兼并引物,首次扩增出异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼细胞周期蛋白B基因2条大小分别约为2.4 kb和2.1 kb的片段.测序及比对分析表明：这3种鱼的细胞周期蛋白B基因2个片段均包含8个外显子和7个内含子.内含子剪切位点符合GT/AG规则,推测细胞周期蛋白B基因2个片段可能是细胞周期蛋白B基因的2种存在形式.异源四倍体鲫鲤与其原始父母本细胞周期蛋白B基因片段序列的比较结果表明：无论是外显子区还是内含子区,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本都具有较高的遗传相似性,在1 025 bp的外显子序列中相同的碱基位点数达963个,为异源四倍体鲫鲤来源于红鲫和鲤鱼提供了分子证据;同时,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本差异碱基位点的存在又表明这一独特的多倍体物种与其原始亲本存在着进化上的变异.此外,还分别以细胞周期蛋白B基因外显子和内含子序列构建了包括异源四倍体鲫鲤及其原始父母本在内的系统进化树.结果初步表明：对于亲缘关系较近的物种,用外显子和内含子序列构建的系统进化树与传统的物种进化树一致;而对于亲缘关系较远的物种,用内含子序列构建的进化树与传统的物种进化顺序存在较大差异.     

革胡子鲇原始生殖细胞的起源、迁移及性腺分化

革胡子鲇又称埃及胡子鲇,是一种多次产卵类型的硬骨鱼。作者用组织学、组织化学、电子显微镜等方法对革胡子鲇的原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)的起源、特征、迁移方式和性腺分化进行了研究。实验结果:PGCs来源于内胚层;PGCs的细胞质中存在着一种与生殖细胞有关的电子致密物--生殖质(Germ plasm);PGCs在迁移过程中有主动迁移的能力;PGCs到达生殖嵴的部位后,与生殖上皮细胞(Epithelisl cells)一起共同形成原始性腺;原始性腺分别逐步向精巢和卵巢分化;生殖质与性腺的分化有密切关系;卵巢的分化比精巢早。       

彩鲫与建鲤杂交F1肠道黏膜显微观察

通过对全红体色彩鲫(Carassius auratuas)与建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)的正反交杂交后代进行消化道生长发育的比较研究,以期为建鲤与彩鲫的远缘杂交生产和研究提供理论依据。本实验选择建鲤亲本、彩鲫亲本、鲤鲫F1(建鲤♀×彩鲫♂)和鲫鲤F1(彩鲫♀×建鲤♂)各50条,每组实验鱼日龄相近。每组选5条体重相近的鱼测量肠长和肠重,并制作肠切片,计算肠重指数、肠长指数、肠道皱襞高度、绒毛长、绒毛宽、肌层厚度数据。数据结果采用SPSS(17.0)软件中的LSD法进行显著性检验。结果表明,以彩鲫作为父本的F1的消化水平高于以彩鲫作为母本的F1,且彩鲫作为父本的F1即鲤鲫F1的消化水平高于两亲本,体现出了杂种优势。     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本遗传变异的微卫星标记分析

采用从鲤中分离出来的32对微卫星DNA标记,对异源四倍体鲫鲤、红鲫和野鲤的基因组DNA进行了研究。在筛选出的15对微卫星引物中,随引物不同,各等位基因数为1～8个,大小在100～420bp之间。从3个不同群体内部的遗传相似系数来看,异源四倍体鲫鲤个体之间的遗传相似系数最大,说明异源四倍体鲫鲤群体内部的遗传变异程度最低,已经形成了一个遗传性状稳定的群体。从3个不同群体之间的遗传相似系数来看,异源四倍体鲫鲤和红鲫遗传相似系数为0．5625,和野鲤的遗传相似系数为0．5125,说明异源四倍体鲫鲤接受原始母本的遗传物质比原始父本野鲤要多一些。微卫星标记与以前报道的RAPD标记的检测结果是相似的,然而由微卫星标记获得的种群内和种群间的遗传距离均大于RAPD,说明微卫星标记比RAPD标记显示出更高的个体多态性。     

小鼠原始生殖细胞的起源,迁移和增殖

哺乳动物原始生殖细胞(PGCs)的起源、迁移和增殖是发育生物学最基本的问题之一,多年来一直未能获得较大突破。近几年,由于实验技术的改进,这一领域的研究有了较大进展。本文以小鼠为例,比较全面地介绍哺乳动物原始生殖细胞的起源、迁移和增殖及其迁移与增殖机制等方面的最新研究进展。     

低氧对体外培养鸡原始生殖细胞凋亡的影响

本研究的目的是通过低氧处理体外培养的鸡原始生殖细胞(Primordial germ cell)优化培养系统,降低细胞凋亡率,提高细胞活力,为高效生产转基因鸡提供科学依据。研究采用低氧气体(1%O_2)分别处理鸡PGCs 6 h、12 h、24 h,随后用q-PCR检测凋亡相关基因Caspase3的表达。与常氧组(21%O_2)相比,1%O_2-24h低氧组Caspase3显著下调(p0.05)。进一步检测1%O_2-24 h低氧组p53和Bcl2的表达情况,结果显示p53表达显著下调(p0.05),Bcl2表达无显著差异。采用流式细胞术检测细胞凋亡比例,低氧组((13.5±0.8)%)凋亡比例低于常氧组((21.8±2.1)%)。采用q-PCR,免疫荧光染色,细胞迁移鉴定低氧处理后的鸡PGCs生物学特性,发现其仍保持生殖细胞的生物学特性。本研究表明,在体外培养条件下,1%O_2低氧处理鸡PGCs 24 h能抑制细胞凋亡,且不改变其生物学特性。     

哺乳动物原始生殖细胞体内特化和体外培养

原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)是胚胎中最先出现的生殖细胞。PGCs来源于上胚层,最早出现在后肠,随后向生殖嵴迁移。这一过程伴随一系列复杂的分子调控机制,以及DNA甲基化重编程和组蛋白修饰等表观遗传过程。PGCs经过不断的分裂、发育及分化,最终形成配子。为了更好地研究PGCs发育与分化的调控和表观遗传过程,体外培养的研究变得越来越重要。本文以小鼠和人为例,介绍了哺乳动物PGCs的特化过程、PGCs特化过程中的表观遗传过程和PGCs的体外培养研究进展。     

二倍体鲫鲤F2产生不同倍性卵子的证据

在检测到鲫鲤F2产生3种不同大小(直径分别为0.13 cm,0.17cm和0.2 cm)类型的卵子基础上,进行了F2(♀)×红鲫(♂)及F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)的交配实验.通过染色体计数和流式细胞仪分析,在F2(♀)×红鲫(♂)后代中获得了四倍体、三倍体、二倍体鱼;在F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)后代中获得了四倍体和三倍体鱼.这两个交配组合后代中出现的不同倍性的鱼类为证明鲫鲤F2能产生三倍体、二倍体和单倍体卵子提供了进一步证据.F2(♀)×红鲫(♂)中雄性四倍体鱼的存在说明在四倍体后代中存在基因型为XXXY的个体.对上述两个交配组合后代的四倍体鱼和三倍体鱼的性腺结构观察表明四倍体鱼是可育的,而三倍体鱼是不育的.作者认为鲫鲤F2能够产生二倍体和三倍体卵子与核内复制机制和生殖细胞的融合有关.     

异源四倍体鲫鲤雌核发育后代及其亲本RAPD分析

异源四倍体鲫鲤是湖南师范大学鱼类发育生物学实验室和湖南湘阴县东湖渔场在红鲫(♀)和湘江野鲤(♂)的杂交后代中选育出来的四倍体鱼,目前已连续繁殖14代(F3-F16),已形成一个四倍体性能代代相传、遗传性状稳定的四倍体鱼群体,这是世界上唯一人工培育的两性可育的异源四倍体鱼[1—2]。利用四倍体鱼与二倍体白鲫、二倍体鲤鱼杂交,可获得生长快、肉质鲜美、抗病力强等优良性状的不育三倍体湘云鲫、三倍体湘云鲤[3],并已在全国28个省市推广养殖,取得了显著的经济和社会效益。异源四倍体鲫鲤雌性个体产生的二倍体卵子具有两套染色体,在没有染色…     

黄河裸裂尻鱼肌酸激酶M-CK cDNA的克隆及组织表达分析

肌酸激酶(CK)能够催化磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之间的可逆性转移,在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)肌酸激酶基因全长c DNA序列,并进行了生物信息学分析和系统发育关系研究。黄河裸裂尻鱼肌酸激酶c DNA全长1 599 bp,开放阅读框(ORF)1 143 bp,编码380个氨基酸,具有典型的N-端结构域和C-端催化结构域。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio)M3-CK有较高的同源性,其序列一致度达94%以上。系统发育分析显示,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼和鲤的M3-CK聚在一支,形成一个单系群,初步判定克隆获得的黄河裸裂尻鱼肌酸激酶基因可能与鲤和斑马鱼M3-CK是直系同源基因。利用Real-time PCR方法检测和分析了黄河裸裂尻鱼主要组织肌酸激酶m RNA表达水平,肌肉、肠、眼、心中肌酸激酶转录本表达较高,在肝胰脏和脑中表达微弱。肌酸激酶在肌肉、肠、和心中高表达与其能量代谢功能相适应,而在眼组织中的高表达是否与肌酸激酶的其他功能相关,有待于进一步研究。     

鲤鲫移核鱼的遗传改良及其后代性状遗传的研究

本研究将鲤鲫移核鱼进行有性杂交,使其遗传性状得到改良,效果显著。实验材料为鲤鲫移核鱼F2 ♂（简称移核鱼）和散鳞镜鲤♀,经杂交获F1（简称颖力）无论当年或二冬龄颖鲤均具有明显生长优势,尤其优于移核鱼。当年颍鲤个体增重平均比双亲快47%,比移核鱼快67%;群体增重平均比双勤快109%,比移核鱼快140%。模糊数学聚类分析表明,颖鲤及其反交在体高、体厚、头长等性状均偏向移核鱼,尤其偏向其雌性个体。