青杄均一化cDNA文库构建及EST序列分析

以青杄花粉和针叶为材料,将青杄全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了其非剪切型全长cDNA原始文库,利用基因组DNA饱和杂交技术对原始cDNA文库进行均一化处理,构建青杄的均一化全长cDNA文库。文库的总库容量为1.1×106CFU/mL,平均插入片段长度大于1.0 kb,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,青杄高丰度表达基因EF1-α在均一化cDNA文库中的表达量下降了约41倍。接着对文库中随机的5 144个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressedsequence tag)序列为5 144条,经拼接共获得单一基因(unigene)为2 717个,其中包括片段重叠群(contig)628个和单一EST序列(singlet)2 089个。NCBI同源比对分析表明,其中1 887个序列unigenes获得分子功能注释,这些EST涉及细胞生长、信号转导、转录、抗逆、能量代谢等功能。这些数据有助于对青杄的相关功能蛋白及分子机制开展进一步的研究。     

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺表达序列标签(EST)分析

以日本七鳃鳗口腔腺为材料,构建库容量为2.1×106pfu/mL的cDNA文库。通过对文库中克隆子的序列测定和生物信息学初步分析,得到1323条有效EST序列。经BlastX及BlastN软件进行同源对比分析,653条(49.36%)EST可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源序列,其中328条与七鳃鳗科物种同源。同源序列功能分类大致分为11类,与蛋白质合成有关的蛋白所占比例最大。1323条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)获得包括547条序列在内的162组片段重叠群并确定了8条全长cDNA。日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库以及EST文库的成功构建,为研究日本七鳃鳗口腔腺的功能基因和蛋白质组学奠定了基础。     

cDNA(EST)文库的高通量生物信息学分析体系的构建与应用

应用生物信息学方法,构建了一套针对cDNA或EST文库的高通量、自动化分析体系,CLASP(cDNA Library Analysis SystemPrimary)。CLASP基于Linux操作系统,主要由Perl程序构成。它以cDNA文库(ESTs)序列为分析对象,具有自动查找序列同源基因并进行染色体定位(包括细胞遗传学定位和SIS定位)、EST自动延伸等功能;并对不同来源序列进行聚类分析。应用该体系对3对肺癌相关抑制性消减杂交(SSH)cDNA文库进行了分析。结果在所有3对文库的2083条EST中有1492条找到了同源基因,其中1365条得到染色体定位。对所余591条未知基因的EST进行了电子延伸,其中有214条EST得到不同程度的延伸。对上述cDNA文库中已知基因的EST以及电子延伸后的EST再分别进行聚类分析,而后综合两个聚类分析的结果,由此可发现不同文库间的共同与差异表达基因,可用于特定性状相关的基因功能预测。     

中华蜜蜂工蜂cDNA文库的构建及ESTs测序分析

【目的】为了解中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂的抗逆性,构建了中华蜜蜂工蜂的cDNA文库,并对文库质量进行分析。【方法】本研究利用SMART技术构建了中华蜜蜂工蜂的全长cDNA文库。【结果】文库库容为3.6×106 cfu/m L,文库重组率为97%,插入片段长度多数分布在1 000 bp左右。挑取cDNA克隆进行EST测序,共进行了306个成功反应,软件拼接共得到234个单基因簇(Unigene),其中包括207个单拷贝(Singletons)序列及27个重叠群(Contigs)。使用Blastx将这些序列同Gen Bank等数据库进行查询、比对和注释,结果显示141条序列有相关同源性,其他序列没有明显的同源性,这也为我们发现新功能基因提供了可靠依据。【结论】此文库的构建在中华蜜蜂功能基因的分离、克隆、筛选以及基因功能研究等方面具有重要作用。     

盐芥(Arabidopsis salsuginea)cDNA文库的随机测序

实验以盐生植物盐芥为材料 ,提取经盐处理的盐芥总RNA ,分离mRNA后 ,构建cDNA文库。从cDNA文库中随机挑取克隆进行测序。结果共测得 5 3个表达序列标记 (EST) ,有 37个EST( 6 9 8% )与拟南芥的基因在多肽水平上有较高同源性 ;2 1个EST( 39.6 % )的功能未知     

中国蛇岛蝮蛇毒腺cDNA文库ESTs序列测定及生物信息学分析

前期我们构建了中国蛇岛蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensis,GSS)毒腺(GSSG)的cDNA(GSSG-cD-NA)文库。本文从构建的GSSG-cDNA文库阳性重组子中随机挑选了216个单克隆进行5’端表达序列标签(EST)单向测序,获得了211条高质量的ESTs。生物信息学序列比对分析结果表明84个克隆为已知功能基因,29个克隆为未知功能基因,98个克隆为新基因,分别占总ESTs的39.8%、13.7%和46.5%。成功获得了GSSG的部分ESTs序列,为GSS蛋白活性组分基因的克隆、表达和功能研究奠定了一定基础。     

铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析

柱花草栽培种热研2号(Stylosanthes guianensis ‘Reyan 2’)对铝毒有较强的耐受性。为了鉴定其在铝胁迫下的诱导 基因, 利用抑制消减杂交(SSH)技术构建在300 μmol·L^–1铝胁迫下正向cDNA文库。挑选插入片段大于300 bp的600个克隆进行测序, 共获得504条表达序列标签(EST)。序列重复性分析表明, 其中12.1%的EST只有1次重复, 61.4%的EST有2–16次重复, 重复出现次数较高的EST是细胞色素P450(53次, 占10.5%)、病原诱导型胰蛋白酶抑制剂(44次, 占8.7%)和衰老相关蛋白(37次, 占7.3%)。BLASTX分析显示, 504条EST中有97种非冗余基因, 其中包括46条功能已知基因和51条功能未知序列。46条功能已知EST中有30个为已报道铝胁迫相关基因, 16个是新发现的铝胁迫相关基因。SSH cDNA文库提供的信息为阐明柱花草耐铝毒的分子机制提供了重要线索。     

家蝇伴侣蛋白TCP-1基因的序列分析、克隆及诱导表达

旨在对EST筛选得到的家蝇伴侣蛋白TCP-1(MD-TCPⅠ)基因进行序列分析,克隆其cDNA序列并在大肠杆菌中诱导表达。采用EST测序技术从已构建的家蝇幼虫cDNA质粒文库中筛选到MD-TCPⅠ基因,对其进行序列测定和分析。以该基因的cDNA文库质粒为模板,通过PCR的方法进行扩增,以pET-28a(+)为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定。结果显示,MD-TCPⅠ基因ORF全长753 bp,编码250个氨基酸,理论分子量27.07 kD;等电点5.92,该序列编码的蛋白属于热休克蛋白60家族的TCP。构建了正确基因序列MD-TCPⅠ重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。     

假密环菌cDNA文库的构建及其阿拉伯糖苷酶基因的克隆(英文)

用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的假密环菌的表达型cDNA文库。文库滴度为1．0×106pfu／ml,重组率约为98．3％,扩增后滴度为3．1×108pfu／ml,容量约为4．2×1010。从文库中随机挑选176个克隆进行5’端测序,得到147条表达序列标签(EST),并将测序结果提交到EMBL数据库。随机测序结果表明:插入片段长度均在200-800之间。测序结果经过生物信息学分析,发现有43条序列与已知序列有明显同源性,其中序列AJ620046与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列有很高的序列一致性。用SMART-RACE技术成功获得了AJ620046的全长cDNA,克隆了AJ620046的开放阅读框AF,并成功构建了重组质粒pHIL-S1-AF,在毕赤酵母菌中进行了初步表达。     

三丁基锡暴露条件下杂色鲍肝胰腺均一化cDNA文库的构建

用RDP试剂提取三丁基锡暴露诱导的杂色鲍肝胰腺总RNA,经Oligotex纯化得到 mRNA;应用SMART技术合成双链cDNA,双链特异核酸酶(DSN)进行双链cDNA的均一化,构建了杂色鲍三丁基锡暴露诱导下的均一化cDNA文库.原始文库的库容为4.3× 106 CFU/ml,重组率为 97.9%.从文库中随机挑选了3 288个克隆进行测序,得到3 048个高质量EST序列,其中有 370条 Contigs,2 103条 Singlets,Unigenes共 2 473条,冗余率为18.86%.以上结果说明该文库质量较好,为进一步筛选相关功能基因打下基础;较低的冗余率说明该文库值得继续使用大规模ESTs测序的方法寻找相关功能基因,并为进一步使用基因芯片技术研究相关功能基因的表达谱提供便利.     

几种全长cDNA文库构建方法比较

全长cDNA文库是高效、大规模获得基因全序列信息的一条有效途径,尤其是对基因组庞大,近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说,是一条开展功能基因组研究的重要途径。本文对几种全长cDNA文库的构建方法进行了概述,针对各种方法的原理及优缺点做了分析、比较,并结合本实验室的结果,重点介绍了Cap-trapper法在小麦全长cDNA文库中的应用及文库中全长基因比例判定方法。     

小麦温敏雄性不育系YM3314育性转换相关基因分析

采用抑制消减杂交技术,构建了小麦温敏不育系YM3314在陕西杨陵秋播(不育环境)和春播(可育环境)幼穗单核期正反交cDNA文库,对获得的136条高质量EST序列采用BLASTx序列比对进行同源性分析,并利用AmiGo和QuickGo浏览器根据GO(gene ontology)数据库对基因表达产物进行功能分类,比较两种育性条件下幼穗cDNA文库的表达谱,以探讨YM3314的育性转换机理.结果显示:不育文库(B库)中初级代谢(13.51%)、转运(13.51%)、抗病与防御(8.11%)以及功能未分类(18.92%)的EST序列所占比例均高于可育文库(K库)中对应的EST序列比例,且分别是K库的2.30倍、1.53倍、2.76倍、1.29倍;K库中与信号传递(14.71%)相关的EST序列所占比例明显高于B库,是B库的2.72倍;两个库中与能量代谢、蛋白质合成、蛋白质修饰/加工/储藏相关的EST序列所占比例相差不大.分析表明,两个文库中与初级代谢、信号传递等有关的基因表达差异可能是导致其育性转换的重要基础.     

夜香树均一化全长cDNA文库的构建及EST分析

为构建高质量的夜香树(Cestrum nocturnum)均一化全长c DNA文库,以其花朵为材料,采用DSN均一化技术与改进的SMART技术相结合,将连接产物进行脱盐浓缩后电转化进行构建。结果表明,未脱盐连接产物的转化效率为1μL连接产物有7000个菌落,理论重组率为96%;脱盐后,提升为4.1×106个菌落,理论重组率为98%;蓝斑也有插入片段,实际重组率应为100%;插入片段大小平均为1.6 kb。随机挑取500个单克隆(含50个蓝斑)测序,共获得464条EST,单一序列(unigene)为426条,占91.8%,其中片段重叠群26个,单基因400个,冗余率仅为8.1%,表明构建文库的均一化效果较好,可满足后续功能基因的筛选和基因信息的研究。     

虾夷扇贝β-actin基因的克隆和序列分析

为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5′端测序,比对,筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。肌动蛋白基因cDNA全长1536bp(不包括polyA),5′端非编码区84bp,3′端非翻译区321bp,阅读框1131bp,编码377个氨基酸。在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。系统发育分析显示该肌动蛋白属于β类型。本研究得到的虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其它功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。     

盐芥（Arabidopsi salsuginea）cDNA文库的随机测序

实验以盐生植物盐芥为材料,提取经盐处理的盐芥总RNA,分离mRNA后,构建cDNA文库。从cDNA文库中随机挑取克隆进行测序。结果共测得53个表达序列标记（EST）,有37个EST（69．8％）,与拟南芥的基因在多肽水平上有较高同源性;21个EST（39．6％）的功能未知。     

铝胁迫下柱花草SSH文库构建及表达序列标签分析

柱花草栽培种热研2号（Stylosanthes guianensis‘Reyan2’）对铝毒有较强的耐受性。为了鉴定其在铝胁迫下的诱导基因,利用抑制消减杂交（SSH）技术构建在300μmol·L-1铝胁迫下正向cDNA文库。挑选插入片段大于300bp的600个克隆进行测序,共获得504条表达序列标签（EST）。序列重复性分析表明,其中12.1%的EST只有1次重复,61.4%的EST有2-16次重复,重复出现次数较高的EST是细胞色素P450（53次,占10.5%）、病原诱导型胰蛋白酶抑制剂（44次,占8.7%）和衰老相关蛋白（37次,占7.3%）。BLASTX分析显示,504条EST中有97种非冗余基因,其中包括46条功能已知基因和51条功能未知序列。46条功能已知EST中有30个为已报道铝胁迫相关基因,16个是新发现的铝胁迫相关基因。SSHcDNA文库提供的信息为阐明柱花草耐铝毒的分子机制提供了重要线索。     

草鱼肠道cDNA文库构建及部分ESTs分析

本项研究以雌性草鱼肠道为实验材料,采用非均一化的Oligo-dT引物定向克隆技术构建了草鱼肠道组织的cDNA文库,对文库质量的分析结果表明：cDNA文库的库容量至少为2．3×10^5,重组率达95％,平均插入片断长度大于1000bp。挑取cDNA克隆进行5’端测序,总共进行了1571个成功反应,其中1411条ESTs长度大于100bp,初步拼接得到939个单基因簇（Unigene）,其中包括188个重叠群（Contigs）,751个单拷贝EST（Singletons）。使用BLAST软件将这些序列同GenBank等数据库进行比对、查询和注释,结果显示418条序列有相关同源性,其他的521（55．5％）条序列没有明显的同源性（E-valu≤1．00E-10）,但是也同时揭示出在这些ESTs中能够发现新功能基因的相当可能性。本研究结果对草鱼以及其他鲤科鱼类的消化系统功能基因的筛选和发现具有指导意义。此外,草鱼肠道cDNA文库的构建和EST测序工作将为草鱼基因组计划的实施奠定基础。     

盐碱地星星草根cDNA文库的构建及初步分析

以盐碱地原位取材的星星草根为材料,利用SMART技术构建了cDNA文库。扩增后文库的滴度为1.747×109CFU/mL,插入片段分布在0.5-2 kb之间,重组率为92%。文库ESTs序列的初步分析表明,从盐碱地星星草根的cDNA文库中筛选到耐盐相关基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶2基因和钙牵蛋白基因的EST片段。该文库可用于进一步从中筛选星星草耐盐基因。盐碱地星星草根cDNA文库的构建为揭示星星草耐盐分子机制、挖掘星星草耐盐基因、培养耐盐植物奠定了重要基础。