植物硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶

植物硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(SAD)是植物脂肪酸合成代谢的关键酶,位于质体基质中,催化硬脂酰-ACP脱饱和形成油酰-ACP的反应。SAD决定着植物饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例,和植物响应温度变化,增强低温适应性有密切关系,并参与防御、膜形成等生理过程。SAD分子是同源二聚体,具特异的二铁中心,其空间结构已被描述。对SAD进行基因工程操作具有广阔的前景。     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖基因的生理和病理意义,利用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总ＲＮＡ中扩增出肥胖基因编码区序列（ＣＤＮＡ）,定向亚克隆至ＰＵＣ１９质粒,克隆的ＯＢＣＤＮＡ不含信号肽序列并加入了亲折起始密友子ＡＴＧ〈序列分析表明,与日本报道的人ＯＢＣＤＮＡ相比,多出一个谷氨酸密码子ＣＡＧ,将ＯＢＣＤＮＡ定向克隆至原功体ＰＢＶ２２０,构建了重组ＯＢ基因表达质粒ＰＢＶ     

乙肝病毒HBx基因克隆及其转基因鼠表达载体构建

乙型肝炎病毒X蛋白HBx与肝细胞癌的发生有很高的相关性。PCR扩增并克隆了HBx基因及其失活突变体HBx-M13。构建了HBx基因及HBx-M13在小鼠肝脏的特异性表达载体。为建立转HBx基因及HBx-M13的小鼠动物模型、进一步研究HBx在肝癌发病过程中的分子生物学机理奠定了基础。     

用于丝状真菌的苯菌灵标记基因benA表达载体的构建

为了构建适用于丝状真菌遗传转化的表达载体,在质粒pAN52-1的高效组成型三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和色氨酸C基因终止子TtrpC之间加入内切酶NotⅠ和ClaⅠ两个位点,构成质粒pAN52-2;把质粒pAN52-2中从启动子PgpdA到终止子TtrpC的基因片段通过PstⅠ和XbaⅠ酶切位点导入到pUC19载体上,并且应用PCR的方法在启动子Pg-pdA的前端引入HindⅢ酶切位点,构成质粒pUCPT-2;通过PCR,在苯菌灵抗性基因benA两端分别加入内切酶NotⅠ和ClaⅠ酶切位点,并克隆到pGEM-T载体上,得到质粒pGEM-Ben;用NotⅠ分别酶切质粒pUCPT-2与pGEM-Ben,连接苯菌灵抗性基因benA到pUCPT-2上,得到了pUCPT-Ben载体。经PCR、酶切和核苷酸序列检测,证实了PgpdA-benA-TtrpC表达元件连接成功,即得到了苯菌灵抗性基因高效表达载体。     

千年桐种子油提取工艺研究及其主要脂肪酸成分分析

本文以氯仿、石油醚和正己烷-异丙醇(3:2,v/v)三种不同溶剂对千年桐种子油进行提取,比较了不同溶剂对种子出油率的影响,结果表明以氯仿为溶剂时出油率最高,达到了35％;并考查了提取时间和提取溶剂体积对出油率的影响.最终优化的提取工艺为:以氯仿为溶剂,液料比为12:1(v/w),提取时间6h,出油率达到了37％.提取的种子油经转酯化后,GC-MS分析其主要脂肪酸组分,结果表明千年桐种子油中总脂肪酸占总油酯的90.55％,其中棕榈酸3.87％,硬脂酸4.11％,亚油酸12.15％,油酸13.31％,亚麻酸12.09％,共轭亚麻酸51.20％和EPA(二十碳五烯酸)3.30％.千年桐种子油中富含不饱和脂肪酸,是一种良好的干性油.     

牡丹PoSAD基因克隆与表达分析

以凤丹牡丹(Paeonia ostii)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,克隆得到凤丹牡丹硬脂酰-ACP去饱和酶基因SAD的cDNA全长,命名为PoSAD(GenBank登录号为KY038819)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 559bp,其中开放阅读框1 197bp,编码398个氨基酸,3′端非编码区长172bp,5′端非编码区长123bp。多序列比对结果表明,凤丹牡丹PoSAD氨基酸序列含有2个保守结构域。系统发育分析结果显示,凤丹牡丹与蓖麻处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PoSAD蛋白无跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性结果分析表明,PoSAD基因在凤丹牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,且在花瓣中表达量最高,雌蕊中次之,在根中的表达量最低;不同时期种子中,60d表达量最高,80d次之,10d中表达量最低。     

Annexin Ⅱ基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人AnnexinⅡ全长cDNA序列,并构建其真核表达载体。方法根据Genbank中AnnexinⅡ基因的碱基序列,利用RT-PCR的方法从人肾脏组织中扩增编码AnnexinⅡ基因,将目的片段与pBS-T载体连接,利用亚克隆的方法将AnnexinⅡ的cDNA片段克隆到pcDNA3.1载体中,并进行序列测定。结果DNA测序证实该片段序列与Genbank完全一致。结论成功克隆人Annexin II全长cDNA序列,并构建出pcDNA3.1—Annexin II真核表达载体,为进一步研究其在肾脏疾病中的作用和机制奠定基础。     

与拟南芥抗寒性相关的CBF3和AtGolS3基因克隆及其表达载体的构建

用RT—PCR技术从拟南芥（Arabidopsis thaliana）克隆到抗寒相关基因CBF3,AtGoIS3,序列分析后用BLAST软件作同源序列分析的结果显示,它们的核苷酸序列与GenBank中登录的拟南芥CBF3（AF074602）,AtGoIS3（AB062850）核苷酸序列完全相同。CBF3丹和AfGoIS3基因分别与植物表达载体pVKH相连构建pVKH-35S-CBF3-pA、pVKH．35S-AtGolS3．pA以及通过中间载体pRT101,将AtGolS3连接到pVKH-35S-CBF3-pA上,成为各自带有35S启动子及PolyA终止子的双价植物表达载体pVKH一35S—CBF3-pA-35S-AtGolS3-pA。     

小麦HMW-GS 12基因克隆及植物表达载体构建

目的:为了利用基因遗传转化改良小麦品质,采用聚合酶链式反应(PCR)技术。方法:从小麦品种东农7742基因组DNA中扩增并克隆了小麦高分子量谷蛋白12亚基基因(HMW-GS 12)。结果:序列分析结果表明,该基因全长1 980bp,其核苷酸顺序和推导的氨基酸顺序与已发表的序列相比,同源性分别为99.5%和99.7%。经过基因拼接,分别构建了胚乳特异性表达和组成型表达的高分子量谷蛋白12亚基基因的两个植物表达载体pDNPPBIHG和pUbPBIHG。     

猪白细胞介素-18基因克隆、序列分析及其真核表达载体的构建

采集6月龄河南良杂猪的脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18全基因序列,序列测定表明,plL-18全基因核苷酸长度为579bp,编码 192个氨基酸。与GenBank上已发表序列ABO10003进行比较,核苷酸同源性为99.8%,在第550位处 (以ATG为1计)由A→G,存在有意义突变。与GenBank下载读取的ABO10003、AF176949、AY262109、NM1997序列进行比较分析,氨基酸同源性分别为99%、98.5%和99.8%、99%。将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA-ILl8m,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为核酸疫苗的研究应用奠定了基础。     

丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展

丝状真菌,俗称霉菌,在食品工业中被用于生产多种生物酶和有机酸。近年来,人们发现丝状真菌具有分泌量大、表达的蛋白有天然活性等特点,非常适合作为同源和异源重组蛋白的表达宿主,因此被广泛研究和探讨。简要综述了以黑曲霉为代表的几种常被用作蛋白表达宿主的丝状真菌的特点、应用中的主要问题和基本解决方案,以及近年关于丝状真菌表达系统的最佳培养条件和发酵条件的研究进展。     

丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展

丝状真菌是具有高效分泌蛋白质潜力的真核表达系统, 能对蛋白质进行翻译后修饰, 如蛋白质糖基化等; 并且比植物、昆虫和哺乳动物细胞具有更快的生长速率。近年来, 随着真菌分子遗传技术和菌种改良策略的进步, 尤其是真菌基因组学的发展, 利用丝状真菌生产异源蛋白越来越受到关注。综述了丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的最新探索与进展, 其中包括功能基因组学在蛋白表达与分泌研究中的应用, 同时探讨了异源蛋白表达和生产的改进策略。     

丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展

丝状真菌是具有高效分泌蛋白质潜力的真核表达系统, 能对蛋白质进行翻译后修饰, 如蛋白质糖基化等; 并且比植物、昆虫和哺乳动物细胞具有更快的生长速率。近年来, 随着真菌分子遗传技术和菌种改良策略的进步, 尤其是真菌基因组学的发展, 利用丝状真菌生产异源蛋白越来越受到关注。综述了丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的最新探索与进展, 其中包括功能基因组学在蛋白表达与分泌研究中的应用, 同时探讨了异源蛋白表达和生产的改进策略。     

丝状真菌蛋白表达系统研究进展*

丝状真菌以其优秀的表达分泌能力和良好的环境适应能力,使得其在蛋白质表达领域应用越来越广泛。近几十年来,通过诱变、培养优化及遗传改造等手段,使得包含曲霉属、木霉属、青霉属等在内的丝状真菌被开发成高效表达宿主。为促进丝状真菌蛋白表达系统的开发,结合作者的研究工作,对工业上丝状真菌表达宿主、蛋白质表达元件及其改造策略进行综述,并探讨了当前丝状真菌表达系统开发过程中的不足之处,为新型丝状真菌表达系统的研究提供参考和启示。     

Filamentous Fungi Associated with Bivalve Mollusks from Polluted Biotopes of Ussuriiskii Bay,Sea of Japan

We have studied for the first time the taxonomic composition of filamentous fungi associated with the bivalve mollusks Crenomytilus grayanus (Bunker, 1853) and Modiolus modiolus (Linnaeus, 1758), collected in polluted biotopes of Ussuriiskii Bay (Peter the Great Bay, Sea of Japan). One hundred fifty-five strains of higher fungi were isolated, and 35 species of filamentous fungi were identified. Out of these, 28 species were anamorphous fungi of the genera Aspergillus (12), Penicillium (10), Acremonium (1), Alternaria (1), Aureobasidium (1), and Cladosporium (3) (Deuteromycota), and 7 were species of the genera Chaetomium (6) and Myxotrichum (1) (Ascomycota). Twenty-four species of filamentous fungi were isolated from the internal organs of C. grayanus: 8 from the muscles, 8 from the hepatopancreas, 6 from the female gonads, 4 from the mantle, 3 from the kidneys and male gonads, and 1 from the gills. Twenty-one species of filamentous fungi were isolated from the internal organs of Modiolus modiolus: 10 from the muscles, 6 from the hepatopancreas, 5 from the female gonads, 3 from the kidneys, 3 from the mantle, and 1 from the gills. The bulk of the isolated species of the genera Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, and Chaetomium were pathogenic and toxigenic fungi.     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD3)基因的部分编码区,该片段cDNA为309 bp,将其克隆到pET-30a(+)载体中,酶切位点分别是BamH I和Sac I,构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,经IPTG诱导蛋白表达,提取蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.酶切鉴定结果表明,LeFAD3基因原核表达载体构建成功,目的蛋白成功表达.     

猪轮状病毒JL94株vp4全基因克隆及原核表达载体构建

根据GenBank已发表的猪轮状病毒vp4基因保守序列,设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株vp4全基因;将扩增产物与载体pMD-18T连接进行序列测定并将测序结果同国外分离株进行序列比较。用限制性内切酶BamHI和SalI将vp4基因从pMD-18T-vp4切下;同样用BamHI和SalI双酶切表达载体pGEX-6P-1;将这2个双酶切产物连接并转化,通过酶切鉴定和PCR鉴定证明完成了vp4原核表达载体的构建。测序结果表明:vp4全基因长2362bp,JL94株同国外分离株BEN307株、Gottfried株vp4全基因片段核苷酸同源性分别为93.44%和69.43%;氨基酸同源性分别为96.06%和71.88%。说明JL94株同BEN-307株属同一VP4血清型,而同Gottfried株属于不同血清型。重组原核表达载体pGEX-6P1-vp4的构建为表达VP4蛋白,研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础。     

中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达

运用限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-lgag基因,并与真核表达载体pCI—neo连接,构建含有中国流行株HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI—neoGAG。经XbaⅠ／SalⅠ双酶切及测序鉴定证实,成功地构建了HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG。通过脂质体将pCI—neoGAG转染入p815细胞,G418筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物。结果表明所构建的HIV-1核心蛋白真核表达载体能在p815细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础。     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunode- ficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的世界广泛流行、严重危害人类健康的疾病.     

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体pEC34中的一段寡核苷酸序列,其中包括翻译增强子序列、SD序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点,插入GST基因后,构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白2A(hBMP2A)和人骨形成蛋白3(hBMP3)C端肽段,将第一顺反子基因（GST基因）切小到原来的1／3时,则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。