马源马链球菌兽疫亚种3株新疆分离株基因型的鉴定及MLST分析

【背景】马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus,SeZ)是引起马腺疫的主要病原,还可引起猪链球菌病,加强该菌的地方株分子流行病学监测对有效防控相关疫病十分必要。【目的】对新疆地区2个马场SeZ分离株进行鉴定和药敏特性分析,并分析3株新疆分离株的分子流行与菌株的遗传进化特征。【方法】对分离纯化的3株病原菌(ZHZ113、ZHZ211和ZHZ523)进行染色观察、生化及药敏特性检测,对16S rRNA和SeM基因进行遗传进化分析,以链球菌7个管家基因arcC、nrdE、proS、spi、tdk、tpi和yqiL为目的基因对3株分离菌进行多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)研究。【结果】3株SeZ的药敏结果显示这3株分离菌对不同抗生素的耐药程度不同,但均对头孢西丁、庆大霉素、链霉素、红霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、土霉素等11种药物敏感。16SrRNA基因序列分析显示这3株分离菌均属于Ⅱ群(兽疫链球菌)。3株菌的MLST分型结果分别为ST39、ST419、ST421型,其中ST419和ST42...     

马链球菌兽疫亚种类M蛋白的基因克隆、序列分析及其在猪源链球菌的检测

根据已发表的马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp .zooepidemicus)马源株的类M蛋白基因序列 ,设计和合成一对引物 ,以兽疫亚种猪源ATCC35 2 4 6株的基因组DNA为模板 ,通过PCR技术 ,扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET_32a( )中 ,测定其序列 ,GenBank接收号为AY2 6 3781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框 ,全长为 1137bp ,编码 379个氨基酸残基。经DNAStar软件分析 ,ATCC35 2 4 6株类M蛋白基因与兽疫亚种马源W6 0株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为 86 9%、30 8%、2 9 4 % ;推导的氨基酸序列的同源性分别为 84 3%、2 1 9%、2 3 4 %。但ATCC35 2 4 6株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验 ,检测 34株猪源链球菌类M蛋白基因 ,发现所有 16株C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因 ,而所有猪链球菌 (Streptococcussuis) 1型和 2型菌株及S群、B群、D群链球菌共 13株均不能检出类M蛋白基因 ,而 5株未鉴定的猪源链球菌中 3株能检测出类M基因。     

猪源链球菌溶血性的检测

用平板法和上清法检测了19株猪源链球菌的溶血性,并通过加入还原剂或氧化剂分别作活化和抑制试验,对各菌株溶血素的性质做了初步鉴定,其中8株猪链球菌2型菌株在血平板上的溶血性较弱,仅为α溶血或弱β溶血,但在THB和5%血清THB中都可产生很强的溶血性,其溶血性可被还原剂活化,被氧化剂和胆固醇所抑制,卵磷脂对其活性则没有影响,属于巯基活化类（类SLO）溶血素,9株马链球菌兽疫亚种菌株在血平板上呈显的β溶血,在不含血清THB中不能产生溶血性,在含血清的THB中可产生较强的溶血性,其活性不被还原剂活化,不被氧化剂抑制,胆固醇能抑制大部分活性,卵磷脂则可全部抑制,属于类SLS溶血素,两株非典型兰氏C群链球菌菌株在血平板上呈显的β溶血,在THB中显示了非常强的溶血性,其活性不被还原剂活化,不被氧化剂抑制或卵磷脂抑制,但被胆固醇强烈抑制,属于非SLO,非SLS溶血素。     

天津地区气单胞菌分离株的鉴定与多位点序列分型

[目的]研究气单胞菌菌株分类情况,并分析其致病性.[方法]采集环境样品和鱼类标本,分离并鉴定气单胞菌菌株,并运用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)方法进行分类研究,利用PCR和测序方法分析毒力基因Aera、Hly、Aha1、GCAT和Nuc的分布.[结果]通过对分离菌株的16S rRNA基因进行分析,确认属于4种不同气单胞菌的7个分离株.发现所有菌株至少有1种毒力基因阳性,其中3株具有4种毒力基因.药物敏感实验显示,6株分离株对3种或3种以上抗菌素具有多重耐药性.最后,对看家基因gyrB、groL、gltA、metG、ppsA和recA进行分析,与MLST数据库中的等位基因序列比对,发现7株分离株均为新的不同的序列型(Sequence type,ST).[结论]气单胞菌具有较高的遗传多样性.     

猪源马链球菌兽疫亚种表达的类M蛋白黏附抑制性单抗的获得

根据马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)猪源株ATCC35246株的类M蛋白基因序列,通过PCR技术,扩增出无信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a( )中。重组质粒经酶切鉴定和测序后,在大肠杆菌BL21中表达,获得60kDa产物,Western blot显示,其与ATCC35246株多克隆抗血清反应,抗原性良好。以His亲和层析柱纯化重组类M蛋白作为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备了12株稳定分泌抗类M蛋白单抗的细胞株,特异性检测显示其与A群链球菌、猪链球菌2型以及马链球菌马亚种等没有交叉反应。单抗亚类鉴定显示,其中6株为IgG1,3株为IgG2,另外3株为IgM。从腹水中纯化的单抗效价为2.56×104~1.01×105。黏附抑制实验显示,其中一株单抗能阻断类M蛋白黏附HEp-2细胞。     

多位点序列分型分析空肠弯曲菌华东动物源分离株

【目的】研究空肠弯曲菌菌株间的分子特征,对不同宿主来源的空肠弯曲菌进行分子分型研究。【方法】选择空肠弯曲菌的7个看家基因gltA、aspA、glnA、glyA、pgm、tkt和uncA作为目的基因,对2006-2008年间华东地区分离的42株空肠弯曲菌样本进行PCR扩增后测序。将测序结果软件分析并上传到数据库进行比对,将结果制作多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)遗传进化树并进行分析。【结果】与数据库已有类型比对,发现了24个新的ST型,通过进化树得到其遗传关系。【结论】MLST方法对于研究空肠弯曲菌的菌株群体基因差异与进化趋势具有重要意义。     

猪源链球菌溶血性的检测*

用平板法和上清法检测了 1 9株猪源链球菌的溶血性 ,并通过加入还原剂或氧化剂分别作活化和抑制试验 ,对各菌株溶血素的性质做了初步鉴定。其中 8株猪链球菌 2型菌株在血平板上的溶血性较弱 ,仅为α溶血或弱 β溶血 ,但在THB和 5 %血清THB中都可产生很强的溶血性 ,其溶血性可被还原剂活化 ,被氧化剂和胆固醇所抑制 ,卵磷脂对其活性则没有影响 ,属于巯基活化类 (类SLO)溶血素。 9株马链球菌兽疫亚种菌株在血平板上呈显著的 β溶血 ,在不含血清THB中不能产生溶血性 ,在含血清的THB中可产生较强的     

光唇鱼源无乳链球菌的分离鉴定及遗传特征

【目的】为查明浙江养殖光唇鱼大量死亡的病原,了解病原的遗传特征。【方法】本工作对患病光唇鱼进行病原分离,结合形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性,对分离菌株进行鉴定;采用人工回感试验确定其病原性,并对分离株的血清型、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、毒力基因型和表面蛋白抗原基因型等遗传特征进行分析;此外,还测试了菌株的药敏特性。【结果】从患病光唇鱼体中分离得到优势菌株ACRO-0708,为革兰氏阳性球菌,不溶血,分子与生化鉴定为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae);人工感染试验证实其对光唇鱼有较强的致病性,LD50为6.47×10~3CFU/g,属于血清型Ⅰb和MLST型ST261,毒力基因型为sip~+bibA~+cfb~+hylB~+iagA~+fbsA~+fbsB~+bac~–bca~–cylE~–scpB~–lmb~–,不携带所检测的6种表面蛋白基因。药敏试验结果显示,对青霉素、氨苄西林等8种药物较敏感,对氯霉素、复方新诺明等7种药物耐药。【结论】引起浙江养殖光唇鱼死亡的病原菌为无乳链球菌,其分子特征与水产动物主要流行的无乳链球菌株具有显著差异,生产中可选用氨苄西林、氟苯尼考等药物进行防治。     

菌种1137116S rRNA序列分析及鉴定

通过PCR方法扩增菌种11371的16S rRNA基因并测序,将序列提交GenBank(登录号:DQ531606),并与其他链霉菌属种进行比较,通过DNAStar软件得到菌种16S rRNA基因序列进化树。同时采用插片法、显微镜观察等方法对株菌11371进行形态特征、培养特征、生理生化特征鉴定。结果表明,11371的16S rRNA序列与其他链霉菌具有一定的同源性,结合生理、生化指标鉴定结果,进一步确定菌种为不吸水链霉菌一株新亚种(Streptomyces ahygroscopicus subsp.wuzhouensis n.sub-sp.),菌株11371 16S rRNA序列为GenBank中首例Streptomyces ahygroscopicus的16S rRNA序列。     

广东与海南养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析

从中国广东、海南罗非鱼主养区发生爆发性疾病的多个养殖场的罗非鱼病鱼体上,分离到多株致病菌株。人工感染试验显示分离菌株具有较强的致病力,有多株经腹部注射分离细菌浓度为1×106CFU/mL时可使100%的受感染鱼死亡,选择其中7株强毒株进行药物敏感性实验与鉴定。不同菌株对药物敏感性存在一定的差异但与菌株来源无相关性,29种抗生素中对13种敏感、7种不敏感、9种存在菌株的差异。各分离菌株均为革兰氏阳性菌,呈β溶血。采用链球菌快速鉴定系统ID32STREP、Lancefield分析及多项补充生理生化鉴定结果,初步判断为无乳链球菌Streptococcus agalactiae。PCR扩增16S rRNA基因和GBS-specific gene cfb(CAMP factor)基因的全长序列,BLAST分析显示所有菌株的16S rRNA基因与GenBank上登录的无乳链球菌的相应序列高度同源(99.8%),各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源(≥99.9%?100%)。各菌株cfb基因序列高度同源(100%),BLAST显示与已知无乳链球菌的相应序列也具有高度同源性(≥99.0%)。综合上述实验结果,可判定广东与海南罗非鱼主养区2009年夏季发生的罗非鱼爆发性疾病的病原菌为无乳链球菌。     

Antioxidant acitivity in vitro and in vivo of the capsule polysaccharides from Streptococcus equi subsp. zooepidemicus

Crude capsule polysaccharides (CCP) were prepared from the culture of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus C55129 and were partially purified through an anion-exchange column chromatography to afford partially purified capsule polysaccharides (PCP). The main component of CCP and PCP was hyaluronic acid. In vitro antioxidant assay, the capsule polysaccharides showed strong inhibition of lipid peroxidation and hydroxyl radical scavenging activity and moderate 1,1-diphenyl-2-picryldydrazyl radical scavenging activity. In addition, CCP exhibited much stronger reductive power than PCP. For antioxidant testing in vivo, CCP and PCP were orally administrated over a period of 15 days in a d-galactose induced aged mice model. As results, administration of capsule polysaccharides inhibited significantly the formation of malondialdehyde in mice livers and serums and raised the activities of antioxidant enzymes and total antioxidant capacity in a dose-dependent manner. However, the antioxidant activity of CCP was lower than that of PCP. The results suggest that the capsule polysaccharides from Streptococcus equi subsp. zooepidemicus C55129 have direct and potent antioxidant activities.     

199株猪链球菌临床分离株血清型、毒力基因及多位点序列分型分析

【背景】猪链球菌（Streptococcus suis,SS）血清型、基因型众多,毒力因子复杂。【目的】了解SS临床分离株血清型、毒力基因分布、分子分型特征及其之间的相关性。【方法】针对199株SS临床分离株,应用PCR技术进行血清分型和毒力基因检测,采用多位点序列分型方法（multilocus sequence typing,MLST）进行基因分型,并分析SS血清型、毒力基因型和序列型（sequence type,ST型）的流行特点及其关联性。【结果】199株SS临床分离株分属于16种血清型（1、2、3、4、6、7、8、9、10、12、15、16、21、24、29和30型）,主要以2、4、3型为主,分别占26.13%（52/199）、14.57%（29/199）和12.06%（24/199）,未定型（NT）菌株占21.61%（43/199）。共鉴定出72种ST型,其中ST1、ST94、ST117、ST7、ST28和ST87为主要ST型,分别占12.56%（25/199）、11.56%（23/199）、9.56%（19/199）、9.04%（18/199）、6.03%（12/199）和3.01%（6/199）,另有24种新发现的ST型（ST1224—ST1227,ST1229—ST1235,ST1241—ST1242,ST1300—ST1310）;分为12个克隆群（cloning complexes,CC）和32个单个ST型。199株SS分离株中毒力基因fbps的检出率最高,为96.98%（193/199）;共有19种毒力基因型,其中66株（33.17%）epf-/mrp-/sly-/gapdh+/fbps+/orf2+型SS为优势毒力基因型。【结论】近年来SS的优势血清型为2、4和3型;ST型具有明显的遗传异质性,种内分化程度较高且与ST型存在一定交叉性;毒力基因分布情况存在差异,毒力基因型呈现多样化。本研究对SS临床分离株的流行特征进行探究,为猪SS病诊断、治疗和制定防控措施提供科学依据。     

不结球白菜BcMPK4基因的分离及表达

为了进一步探讨植物MAPKs(mitogen-activated protein kinases)在植物防卫中的作用,该研究从不结球白菜抗病品种‘苏州青’中克隆到一个抗核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)相关基因,命名为BcMPK4(DDBJ登录号AB557751)。该基因核苷酸序列全长1 334bp,编码373个氨基酸,与已克隆的MPK4基因有不同程度的相似性。系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性。基因组DNA杂交表明,BcMPK4可能属于一个较小的多基因家族,属组成型表达。实时定量PCR检测表明,核盘菌能够诱导不结球白菜BcMPK4基因的转录表达;BcMPK4基因在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对核盘菌的抗性。     

乌鳢源杀鱼爱德华菌的分离鉴定及药敏特性研究

【背景】江苏省扬州市某乌鳢养殖场发生疾病,给养殖户造成了严重的经济损失。【目的】确定病因并筛选出敏感药物,为乌鳢相关疾病的防治提供参考。【方法】从患病乌鳢体内分离致病菌,并从形态、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测等方面对分离菌株进行鉴定,同时开展人工感染试验分析其致病性,通过纸片扩散法进行药敏特性分析。【结果】从患病乌鳢体内分离获得优势菌株SHL,经形态特征、理化特性、16SrRNA和gyrB基因序列及特异性PCR检测鉴定为杀鱼爱德华菌。进一步人工感染试验证实其对乌鳢有较强的致病性,LD50为1.6×105 CFU/g,发病症状与自然发病症状相似。药敏试验结果显示,该菌株对青霉素、氯霉素、四环素等28种抗菌药物高度敏感,对红霉素中度敏感,对苯唑西啉、克拉霉素、万古霉素等6种药物耐药。【结论】引起江苏省扬州市某养殖场的乌鳢体表溃烂及死亡的病原菌为杀鱼爱德华菌,这是我国首次从淡水鱼类中检出致病性杀鱼爱德华菌,表明该菌的感染谱在扩大,需引起水产养殖领域的重视,在养殖过程中可根据药敏实验结果选用合适的国标渔药进行防治。     

凡纳滨对虾肠道红杆菌科细菌富集碳源筛选及其定向分离

【目的】红杆菌科(Rhodobacteraceae)细菌为凡纳滨对虾肠道微生物的优势类群,在健康对虾肠道中具有较高的相对丰度,是指示对虾健康的关键类群,探究对虾肠道红杆菌科细菌定向富集和分离方法,可为对虾养殖益生菌菌剂的研发提供基础。【方法】利用16S rRNA基因高通量测序技术研究不同碳源添加对凡纳滨对虾肠道中红杆菌科细菌的富集作用,筛选对红杆菌科细菌有显著富集作用的碳源;利用纯培养技术从红杆菌科细菌富集的样品中定向分离红杆菌科细菌,并对其进行鉴定和遗传多样性分析。【结果】添加短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)和碳酸氢钠对红杆菌科细菌有显著富集作用,主要富集到Cribrihabitans、Tritonibacter、Rhodovulum、Ruegeria、Sagittula和Thalassobius属相关菌株;对红杆菌科细菌相对丰度最高的样品进行稀释涂布培养,共分离纯化出303株细菌,分属于2门12科,其中红杆菌科细菌为主导类群共119株,主要包括Tritonibacter (90株)、Phaeobacter (25株)、Sulfitobacter (1株)、Ruegeria (1...     

Comparison of whole wood and cellulose carbon and oxygen isotope series from Pinus nigra ssp. laricio (Corsica/France)

Stable isotopes in tree rings have widely been used for palaeoclimate reconstructions since tree rings record climatic information at annual resolution. However, various wood components or different parts of an annual tree-ring may differ in their isotopic compositions. Thus, sample preparation and subsequent laboratory analysis are crucial for the isotopic signal retained in the final tree-ring isotope series used for climate reconstruction and must therefore be considered for the interpretation of isotope–climate relationships. This study focuses on wood of Corsican Pine trees (Pinus nigra ssp. laricio) as this tree species allows to reconstruct the long-term climate evolution in the western Mediterranean. In a pilot study, we concentrated on methodological issues of sample preparation techniques in order to evaluate isotope records measured on pooled whole tree-ring cellulose and whole tree-ring bulk wood samples. We analysed 80-year long carbon and oxygen chronologies of Corsican Pine trees growing near the upper tree line on Corsica. Carbon and oxygen isotope records of whole tree-ring bulk wood and whole tree-ring cellulose from a pooled sample of 5 trees were correlated with the climate parameters monthly precipitation, temperature and the self-calibrating Palmer Drought Severity Index (sc-PDSI). Results show that the offsets in carbon and oxygen isotopes of bulk wood and cellulose are not constant over time. Both isotopes correlate with climate parameters from late winter and summer. The carbon and oxygen isotope ratios of cellulose are more sensitive to climatic variables than those of bulk wood. The results of this study imply that extraction of cellulose is a pre-requisite for the reconstruction of high-resolution climate records from stable isotope series of P. nigra ssp. laricio.     

拟诺卡氏菌16S rRNA,gyrB,sod和rpoB基因的系统发育分析

为了更好地了解拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)各物种间的系统发育关系,该属现有有效描述种的gyrB,sod和rpoB基因的部分序列被测定,结合16S rRNA基因,对拟诺卡氏菌属进行了系统发育重建。研究发现拟诺卡氏菌属gyrB,sod和rpoB基因的平均相似性分别为87.7%、87.3%和94.1%,而16S rRNA基因的平均相似性则达到96.65%,3个看家基因均比16S rRNA具有更高的分歧度。比较基于不同基因的系统树发现,由gyrB基因得到的系统树拓扑结构与16S rRNA得到的结构在亚群上基本一致。因此,gyrB基因在拟诺卡氏菌属的系统分类上比16S rRNA基因更具优越性。