正交设计优化紫萼藓科植物的ISSR-PCR反应体系

目的:建立紫萼藓科(Grimmiaceae)植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:通过L16(45)正交试验,研究了dNTP浓度、镁离子浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响。结果:建立了紫萼藓科ISSR-PCR反应的最佳反应体系,其中dNTPs浓度为0.8mmol/L、Mg2+浓度为3.0mmol/L、模板为15ng、引物浓度为1.4μmol/L、Taq酶量2U,总体积为25μl。反应程序为:扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～52℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min;4℃保存。采用引物UBC812等均能够得到有效扩增。结论:该优化体系的建立为下一步对紫萼藓进行ISSR分子标记奠定了基础。     

正交设计优化金发藓科植物ISSR-PCR反应体系

目的:建立金发藓科植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:利用正交设计的方法,对金发藓科植物(Polytrichaceae)IS-SR-PCR反应的5因素(Mg2 ,dNTP,primer,DNA template,Taq DNA polymerase)4水平进行试验。结果:在20μl反应体系中,模板DNA50ng,1.6μmol/L的引物,1×反应缓冲液,3.2mmol/L的Mg2 ,dNTP为1.2mmol/L,2U的TaqDNA聚合酶,反应程序为94℃预变性6min;94℃变性45s,57℃退火45s,72℃延伸2min,循环40次;72℃延伸10min。利用此结论,对20种金发藓科植物进行ISSR-PCR扩增,扩增产物的多态性为69.52%。利用引物841构建的指纹图谱,可区分20种金发藓科植物中的18种,分辨率达90%。金发藓科植物ISSR-PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR标记技术开展金发藓科植物种间遗传多样性分析提供一个标准化程序。     

正交设计优化落叶松ISSR-PCR反应体系

该文利用正交试验设计的方法,对落叶松ISSR-PCR反应的5因素4水平进行试验,试验结果运用MINITAB软件进行分析,建立了落叶松ISSR-PCR反应的最佳体系,即在20μl反应体系中,模板50-200 ng,0.5μmol/L的引物,1×反应缓冲液,dNTP为0.15mmol/L-0.2mmol/L,1U的TaqDNA聚合酶,Mg2 2.0mmol/L-2.5 mmol/L。并进一步进行梯度退火试验,找到了最适的落叶松ISSR退火温度为56.4℃。     

利用正交设计法对叉叶苏铁ISSR-PCR反应体系的优化研究

比较CTAB法和SDS法提取叉叶苏铁（Cycas micholitzii）的总DNA,发现CTAB法是提取叉叶苏铁总DNA的较好方法;对叉叶苏铁ISSR-PCR反应体系中的4个主要因素dNTPs,Taq DNA聚合酶,引物及Mg²⁺进行最优条件筛选;采用单因素法探讨DNA模板量、退火温度和循环次数的最佳反应条件,建立了适合于叉叶苏铁的最佳ISSR-PCR反应体系 （20 μL体系）： 1×Buffer,75 ng DNA模板,dNTPs 250 μmol·L^-1, Taq酶1.0U,引物0.2 μmol·L^-1,Mg2+ 2.5mmol·L^-1,反应程序为：94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸2 min,循环40次,72℃延伸10 min,4℃保存。本研究结果为苏铁纲植物的分子生物学和分子系统学研究提供理论参考。     

利用正交设计优化小苍兰ISSR-PCR反应体系

通过L₁₆(4⁵)正交试验,研究了镁离子浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响,建立了适合于小苍兰ISSR-PCR的反应体系。优化体系为：25 μL PCR反应体系中含有1×Taq酶缓冲液(10 mmol·L^-1 KCl,8 mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄,10 mmol·L^-1 Tris·HCl,pH 9.0,0.05% NP-40),2 mmol·L^-1 MgCl₂,0.06 U·μL^-1 Taq酶,0.4 μmol·L^-1引物,4.0 ng·μL^-1模板DNA,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.6 mmol·L^-1。利用温度梯度PCR,确定了最适宜的退火温度为51.5℃。该优化体系的建立为下一步对小苍兰进行ISSR分子标记奠定了基础。     

黑木耳ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验设计的方法,对黑木耳ISSR-PCR(简单重复序列区间-多聚酶链反应)反应体系中的5种主要因素(Taq聚合酶,Mg2+,模板DNA,dNTP及引物)4个水平进行优化筛选,确立了适合黑木耳ISSR分析的优化反应体系(20μL),通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。     

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

正交设计优化东亚砂藓DDRT-PCR反应体系

利用正交实验设计L25（5^6）对东亚砂藓（Racomitrium japonicum）DDRT—PCR反应体系的6因素（Mg^2＋、dNTP、锚定引物、随机引物、模板DNA、Taq酶）在5个水平上进行优化实验。结果筛选出各反应因素的最佳体系（20μL）为：Mg^2＋2．25mmol／L、dNTP0．4mmol／L、锚定引物1．0μmol／L、随机引物0．7μmol／L、模板DNA1．6μL、Taq酶2．5U。对东亚砂藓DDRT—PCR最佳反应体系进行梯度PCR引物退火温度筛选,得到的最佳退火温度为45．4℃。该优化体系的建立,为进一步进行东亚砂藓抗旱基因的筛选与克隆等一系列分子研究提供了重要参考依据。     

利用正交设计建立与优化北美驼绒藜ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计的方法,对北美驼绒藜ISSR-PCR反应的5因素(Taq酶、dNTP、引物、Mg²⁺和模板DNA)4水平进行试验,试验结果运用MINITAB软件进行分析,建立了适合北美驼绒藜的既稳定又谱带多的ISSR-PCR最佳反应体系,即20 μL的反应体系中含有1×buffer,1.5 U Taq酶,0.2 mmol·L^-1 dNTP,0.5 μmol·L^-1引物,2.5 mmol·L^-1 Mg²⁺和10 ng模板DNA。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR技术进行驼绒藜属植物种质资源分类、遗传图谱构建和遗传变异奠定了技术基础。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验与单因素设计相结合的方法,对四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系中的4种主要因素(Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化筛选,PCR结果用统计软件SPSS16.0分析。结果显示,Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP这3因素的不同水平对PCR反应结果都有显著影响,其中Mg2+的浓度影响最大。筛选出各反应因素的最佳水平,建立四数獐牙菜ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为3.0 mmol/L Mg2+,250μmol/L dNTP,0.6μmol/L引物,1UTaqDNA聚合酶,40 ngDNA,2.5μL10×buffer。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行四数獐牙菜遗传多样性分析以及物种保护奠定了技术基础。     

大苞萱草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用正交设计和单因子试验两种方法对影响大苞萱草ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2+,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验。正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平。单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平。两种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了大苞萱草ISSR-PCR的最佳反应体系。在20μL的反应体系中:Taq酶1 U,Mg2+1.5 mmol/L,dNTP0.20 mmol/L,引物0.4μmol/L,1×PCR buffer,30 ng模板DNA。在此基础上筛选出10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。     

野生毛木耳ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为获得条带清晰,重复性好,多态性高的野生毛木耳ISSR扩增结果,通过单因子试验对ISSR-PCR反应条件进行了优化。确定了ISSR分析的最佳PCR条件:25μL反应体系中模板DNA25ng、dNTPs0.24mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+0.9mmol/L、引物2μmol/L、10×PCR buffer2.5μL、ddH2O12.6μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。在此基础上初步筛选出25条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行野生毛木耳种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个适合的程序。     

均匀设计优化建兰ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响建兰ISSR-PCR体系的引物、Mg^2＋、dNTP和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化,建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,舍引物0．25μmol／L、Mg^2＋ 2．5mmol／L,dNTP0．2mmol／L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA40ng．在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度,以及ISSR引物进行筛选．筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min;接着进行32个循环：94℃变性35S,52～56℃退火45S,72℃延伸90s;循环结束后,72℃延伸10min．同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物．     

黑籽南瓜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

以云南个旧黑籽南瓜叶片基因组DNA为模板,固定反应程序,采用L_(16)(4~5)正交试验设计的方法,对影响ISSR-PCR反应的五因素(dNTPs,Mg~(2+),引物,Taq DNA聚合酶,模板DNA)在四个水平上进行优化试验。研究建立起了适于云南黑籽南瓜ISSR-PCR的最佳反应体系:25μl反应体系中含10×buffer 2.5μl、0.15mmol/L dNTPs、2.5mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、1.5U Taq DNA聚合酶、DNA模板15ng。扩增程序为:95℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸90s,进行35个循环,最后72℃延伸7min。该优化体系的建立为今后用ISSR标记技术进行黑籽南瓜种质资源的分类鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。     

栝楼ISSR-PCR反应体系的建立和优化

用改良SDS法提取栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)叶片DNA为模板,通过单因素试验研究模板、引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs等4因素各7个水平对栝楼ISSR-PCR扩增结果的影响,并通过正交试验对各因子的浓度进行优化,首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系:20 μL的反应体系中,1×buffer,模板含量为50 ng,引物的浓度为0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为0.8 U,dNTPs的浓度为200 μmol/L.随机选取10条引物验证体系稳定性,并对190条ISSR引物初筛,得到条带清晰、多态性好的引物126条.经验证,本实验所建立的栝楼ISSR-PCR反应体系具有稳定可靠、可重复性好、多态性较强等特点,能够较好的应用于栝楼的ISSR分子生物学分析.