人星状病毒非结构蛋白基因nsP1a/1真核表达载体构建及其

目的 将人星状病毒非结构蛋白nsP1 a./1基因连接到真核表达载体上,转染人胚肾上皮细胞48 h后检测其表达.方法 设计特异性引物PCR扩增人星状病毒非结构蛋白nsP1 a/1片段,分别插入真核表达载体pcDNA3.1(+)和pEGFP-N2载体,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-nsP1a/1-His和pEGFP-N2-nsP1a/1.在转染试剂PEI的介导下将重组表达质粒分别转染293T细胞,转染48 h后分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达以及通过Western blot检测nsP1a/1基因的表达.结果 重组表达质粒pcDNA3.1(+)-nsP1a/1-His和pEGFP-N2-nsP1a/1构建成功;转染pEGFP-N2-nsP1a/1后48 h能够在荧光显微镜蓝色激发光下观察到较强的黄绿色荧光;转染pcDNA3.1(+)-nsP1a/1-His后48 h收集细胞进行Western blot检测,能够检测到nsP1a/1-His融合报告基因的表达.结论 成功构建了人星状病毒非结构蛋白nsP1a/1基因真核表达质粒,并在人胚肾上皮细胞293T细胞获得表达,为进一步深入研究nsP1a/1在人星状病毒抵御宿主细胞抗病毒天然免疫中是否发挥作用奠定了基础.     

Rab GDP解离抑制因子的定位和表达

目的:构建含人GDI1和GDI2基因的真核表达载体进行定位和蛋白表达研究。方法:用PCR从U251细胞cDNA克隆GDI1和GDI2基因,构建真核表达载体pEGFP-N2-GDI1和pEGFP-N2-GDI2,转染HEK293T细胞。荧光显微镜观察GDI1和GDI2蛋白的细胞内定位,再通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定蛋白的表达。结果:成功克隆到1 341bp和1 335bp的人源GDI1和GDI2基因,并准确插入真核表达载体pEGFP-N2中,荧光观察这两个蛋白定位到细胞浆中,并能利用标签抗体检测到GDI1和GDI2的表达。结论:GDI1和GDI2能够定位到细胞浆,并能通过Western blotting检测,为进一步研究GDI1和GDI2的功能奠定了基础。     

HCMV IE86对ARPE-19细胞周期的影响

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE2,瞬时转染ARPE-19细胞,探讨其时视网膜色素上皮细胞周期的影响.方法:采用PCR方法从质粒pIEP86AD169扩增出IE2片段,将其定向克隆于pEGFP-N3,构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE2,酶切、测序鉴定,脂质体介导瞬时转染ARPE-19细胞,RT-PCR、免疫荧光法分析IE2基因在mRNA和蛋白水平的表达.流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化.结果:成功构建重组质粒pEGFP-N3-IE2,并在被转染细胞中检测到IE2基因的表达;瞬时转染后细胞周期表现为S期细胞比例显著增高.结论:成功构建pEGFP-N3-IE2真核表达质粒,重组质粒能在ARPE-19细胞中顺利表达IE2,IE2基因可以引起ARPE-19细胞的细胞周期S期阻滞.     

293T细胞中SQSTM1/p62-GFP的表达及其与LC3在诱导自噬状态下的定位分布

为探究SQSTM1/p62蛋白在细胞发生自噬时的定位,以人肺腺癌A549细胞的cDNA为模板,PCR扩增SQSTM1基因(编码p62蛋白)并将其插入pEGFP-N1真核表达质粒.将重组质粒转染进入人胚肾293T细胞中表达p62绿色荧光融合蛋白(GFP-p62),利用Earle's盐平衡溶液饥饿诱导细胞自噬,Wester...     

真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1的构建及鉴定

目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因Nurr1的真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1,并检测其在293T细胞中的表达。方法:采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从大鼠黑质中获取Nurrl基因,连接T载体测序正确后与真核空载体pIRES2-EGFP一起,经Nhe1和Xho1双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建pIRES2-EGFP-Nurr1;真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1测序正确后采用脂质体法将其转染293T细胞,倒置荧光显微镜下观察转染效率,PCR检测Nurr1基因mRNA水平的表达情况,免疫印迹试验(Western Blot)检测Nurr1蛋白的表达水平。结果:酶切及测序鉴定证实成功构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1;293T细胞转染pIRES2-EGFP-Nurr1后可以高度表达绿色荧光,有效转录Nurr1基因并正确的高表达Nurr1蛋白。结论:成功构建Nurr1真核表达载体且在293T细胞中高水平表达,为进一步转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),基因治疗帕金森病奠定基础。     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。     

H1N1流感病毒血凝素对人肺细胞的损伤作用及机制研究

目的:研究H1N1流感病毒血凝素HA对人胚肺成纤维细胞的损伤作用并初步探讨其机理。方法:合成2009 H1N1的HA基因全长,分别将HA的PCR产物和pEGFP-N1质粒经Hind Ⅲ和EcoRI酶切电泳、纯化、连接并转化大肠杆菌DH5α,构建真核表达质粒pEGFP-N1/HA。质粒转染293细胞,检测其转染效率,并收获细胞总蛋白进行Western blotting检测。将阳性质粒转染MRC-5细胞,CCK-8检测HA的表达对细胞增殖活性,线粒体膜电位检测试剂盒检测其对细胞的早期凋亡的影响,ATP检测试剂盒检测HA的表达对ATP水平的改变。结果:PCR电泳检测获得分子量为1700 bp左右的目的条带,菌落PCR鉴定HA片段成功插入pEGFP-N1载体。荧光显微镜下检测pEGFP-N1/HA转染293细胞有明显荧光,Western blotting结果显示pEGFP-N1/HA转染细胞有单一的目的蛋白表达。HA的表达可明显抑制MRC-5细胞活力,HA的高表达降低MRC-5细胞的线粒体膜电位及ATP水平。结论:H1N1流感病毒HA对人肺细胞的损伤作用可能与影响肺细胞的线粒体功能有关。     

大鼠p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建大鼠p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)cDNA序列的绿色荧光真核表达载体并鉴定其在人胚肾293(human embryo kidney 293,HEK293)细胞中的表达.方法:采用PCR方法从含野生型大鼠p75NTR的pDC316-RP75质粒中扩增目的片段,经EcoRⅠ和SaⅡ双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达栽体pEGFP-N1-RP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及免疫组织化学法鉴定大鼠p75NTR的表达.结果:重组质粒经酶切鉴定和序列分析证实含有大鼠p75NTR的编码序列,转染后经激光共聚焦显微镜及免疫组织化学染色观察表明重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的大鼠p75NTR片段.结论:大鼠p75NTR绿色荧光真核表达栽体构建成功并可在HEK293细胞中表达,为进一步研究奠定了基础.     

小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的：应用质粒pEGFP-N1构建含小鼠survivin基因的重组真核载体。方法：采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,自行设计一对分别含有HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的survivin基因上下游引物,利用PCR扩增出该基因的全序列cDNA,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1/survivin重组真核表达载体。然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果：双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组真核表达载体。结论：重组真核表达载体pEGFP-N1/survivin构建成功,为下一步研究sur-vivin在未成熟树突状细胞中诱导分化与致耐受作用奠定基础。     

HGF基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

目的:构建真核表达质粒p EGFP-N1-HGF并观察干细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在人皮肤成纤维中的表达。方法:从扩增人的间充质干细胞中提取全长RNA为模板,设计合成引物,用RT-PCR法扩增出HGF基因片段,然后将HGF基因片段连接于真核表达质粒p EGFP-N1中。双酶切鉴定及测序分析后,用脂质体包裹转染体外培养的人的皮肤成纤维细胞,通过荧光显微镜观察其转染效果,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HGF蛋白的表达。结果:经酶切鉴定及测序验证p EGFP-N1-HGF构建正确,经转染的人皮肤纤维细胞中观察到较强的绿色荧光并且可以表达一定量的HGF。结论:成功构建了真核表达质粒p EGFP-N1-HGF,为基因治疗脱发疾病提供实验基础。     

艾滋病患者APOBEC3G 基因的克隆和真核表达

目的 建立艾滋病( AIDS) 患者载脂蛋白B mRNA 编辑酶催化多肽样蛋白3G( APOBEC3G) 的真核表达体系。方法 采用反转录-聚合酶链反应( RT-PCR) 技术从AIDS 患者外周血单个核细胞( PBMC) 中获取APOBEC3G 基因编码区, 将其克隆到pMD18-T载体上, 测序验证正确后再将其转接入真核表达载体pEGFP-N1 中, 然后将重组质粒pEGFP-N1-A3G 转染HEK293T细胞, 分别用RT-PCR 法和蛋白印迹法( Western 印迹法) 验证APOBEC3G 在mRNA 和蛋白水平的表达。结果 从AIDS 患者体内克隆的APOBEC3G 基因编码区长度为1 154 bp, 测序结果与GenBank 中APOBEC3G 参考序列( NM021822) 比对发现存在2 处差异, 分别位于mRNA 第588 位和746 位碱基处。重组质粒pEGFP-N1-A3G转染HEK293T 细胞, 在荧光显微镜下观察到融合蛋白A3G-EGFP的表达, RT-PCR 法和Western blot 法分别验证了蛋白在mRNA 和蛋白水平的表达。结论 成功构建了AIDS 患者APOBEC3G 蛋白的真核表达体系, 为进一步研究APOBEC3G 在HIV-1 感染中的作用奠定了基础。     

人ANKRD49基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究和RNA干扰靶点的鉴定

目的: 克隆人ANKRD49基因并构建其真核表达重组体,利用构建成功的ANKRD49真核表达重组体对其进行功能的初步研究,并筛选和鉴定其RNA干扰靶点. 方法: 提取人肺腺癌细胞株A549总RNA,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对ANKRD49进行扩增,扩增产物与真核表达载体p3×Flag-CMV-14同时进行双酶切,酶切产物连接后转化入感受态细胞Top10,阳性重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法(Lipofectamine^TM 2000)转染人胚肾细胞(HEK 293T),免疫印迹(Immunoblotting)和免疫荧光技术检测表达产物.免疫荧光法检测ANKRD49在宿主细胞内的定位.MTT法检测ANKRD49对宿主细胞的增殖作用.设计并合成针对人ANKRD49基因的RNA干扰靶点序列,与p3×Flag-CMV-14/ANKRD49共转染HEK 293T细胞后,Immunoblotting鉴定ANKRD49的RNA干扰靶点. 结果: RT-PCR结果显示,从A549细胞中扩增出约720 bp的片段.菌液PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49构建成功且序列正确.免疫荧光和Immunoblotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/ANKRD49的细胞中有ANKRD49的表达,蛋白质相对分子质量(Mr)约为27kDa,而转染空质粒组未见表达.MTT结果显示,ANKRD49对细胞增殖没有影响.共转染实验结果显示,1号和4号RNA干扰序列可以有效降低人ANKRD49的表达. 结论: 成功构建了真核表达重组体p3×Flag-CMV-14/ANKRD49,该蛋白质位于细胞核,不参与细胞增殖;同时鉴定出该基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究其功能奠定了基础.     

人Tim-3基因真核表达载体的构建及表达

目的：为了构建可在真核细胞中高效表达人Tim-3（hTim-3）的真核表达质粒,以便用于hTim-3肿瘤免疫治疗研究。方法：取健康人外周血的单个核细胞,用高保真聚合酶扩增hTim-3基因,先进行hTim-3基因的亚克隆,用Bgl II和SalI限制性内切酶切下带有酶切位点的hTim-3基因,最终构建hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3。用脂质体方法转染质粒至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。48h后荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。结果：酶切和测序鉴定证实目的基因hTim-3正确插入到真核表达载体pEGFP—N1中,转染肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了可在真核细胞中高效表达hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3,为进一步研究hTim-3的肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人存活蛋白（survivin）-2B主要T细胞表位区域、人和猴绒毛膜促性腺激素β链的核心片段CTP37区域融合基因的真核表达质粒,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法：通过基因合成和搭桥PCR技术构建含有Survivin2B主要T细胞表位区域、人和猴CTP37区域基因的融合基因2PAG,将其插入含有人IgK链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI—Fc—GPI中,继而又将酶切后的sig2PAG-FC-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点（IRES）基因且可以共表达人GM-CSF和B7．1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM／B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-2PAG-FC-GPI-GM／B7（简称pVAX1-2PFcGB）转染293T细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果：2PAG融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pVAX-IRES-GM／B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-2PFcGB在293T细胞中得到很好的表达。结论：成功构建了重组质粒pVAX1-2PFcGB,且在293T细胞中可以有效表达,为对该基因疫苗的后续功能研究奠定了基础。     

Kras突变基因真核表达载体的构建及在不同肝细胞株中的表达

目的：构建携带突变Kras基因,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导入两种不同的肝细胞株中表达。方法：PCR扩增突变Kras目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。并利用脂质体转染人肝癌细胞株Huh7．5和鸡肝癌细胞株LMH,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察Kras-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;用WesternBlotting方法验证Kras蛋白水平的表达。结果：酶切和测序证实pEGFP—N1-Kras重组质粒构建正确,将EGFP报告基因融合在突变的Kras基因的3’端;在Huh7．5和LMH中均观察到了绿色荧光,转染率分别为19％和53％;WesternBlott—ing也检测到融合蛋白的表达。结论：通过基因克隆方法成功构建了pEGFP—N1-Kras重组质粒载体,并且在Huh7．5和LMH中均稳定表达,为下一步筛选针对突变Kras基因的靶向药物奠定了基础。