一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究

【目的】分离获得β-葡萄糖苷酶高产菌株,确定该菌分类地位,并对其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行初步研究。【方法】采用七叶灵显色法从土壤样品中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,再用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)显色法进行复筛;通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列相似性分析等方法确定其分类学地位;利用超滤、疏水层析、阴离子层析、分子筛层析法对β-葡萄糖苷酶进行分离纯化;以PNPG为底物,测定β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及最适反应温度,通过双倒数作图法确定β-葡萄糖苷酶催化不同底物水解的米氏常数Km值。【结果】从土壤样品中筛选得到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株ZF-6C,初步鉴定为Bacillus korlensis;芽胞杆菌ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶的分子量约为90 kD,最适反应pH和温度分别为7.0和40°C,该酶具有水解β(1,4)糖苷键的活性,最适底物为邻硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,Km值为0.73 mmol/L。金属离子Ca2+、Pb2+增强酶活,而Cu2+、Fe2+抑制酶活。【结论】首次报道从Bacillus korlensis中分离得到β-葡萄糖苷酶,Bacillus korlensis ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶在分子量、最适反应条件及底物特异性等方面均不同于已知酶,可能为一结构新颖且催化效率较高的β-葡萄糖苷酶。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

通过测定黑曲霉β-葡萄糖苷酶的底物特异性,表明该酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。Ag~+、Cu~(2+)和Hg~(2+)对该酶有较强的抑制作用。该酶水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、水杨苷和纤维二糖的Km值分别为2.32、19.11和30.18mmol/L,V_(max)则分别为412、237和198μmol·min~(-1)·mg~(-1),Lineweaver-Burk作图法表明,D-葡萄糖和δ-葡萄糖酸内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为5.17和1.31mmol/L。     

根霉α-半乳糖苷酶的三相分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp. A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种     

一株嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性

研究了液体发酵嗜热毛壳菌Chaetomium thermophile产生的β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为78.4kDa和81kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为60℃和4.5-5.0。有较好的酸稳定性和热稳定性。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大, 其中Ca2+对酶有激活作用, 而Ag+、Cu2+ 、Hg2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。     

烟管菌漆酶的分离纯化及部分酶学性质研究

烟管菌Bjerkandera adustaWZFF.W-Y11漆酶粗酶液经过丙酮分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤,得到了三种电泳纯的漆酶同工酶,总酶活回收率达到65.5%,其中LacA平均纯化了29.2倍,LacB纯化了5.1倍,LacC纯化了18.5倍;三种同工酶的分子量分别为LacA:68.7kDa、LacB:80.2kDa、LacC:77.2kDa。LacA、LacC氧化愈创木酚的Km大于氧化ABTS的Km,最适作用温度在45-70℃,最适反应pH3.0-5.5,65℃时LacC比LacA稳定,LacC在pH3.5-6.0稳定,LacA在pH5.0-9.0稳定,Al3+对LacA、LacC的酶活有促进作用,Cl-、Fe3+、Hg2+抑制LacA、LacC的酶活,Cu2+抑制LacC的酶活,而对LacA的活性没有明显影响。     

烟曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

探索获得优良的β-葡萄糖苷酶基因,对实现其工业化生产具有重要意义。烟曲霉Aspergillus fumigatus基因组中含有一个bgl基因(1 752 bp),编码的蛋白约65 kDa,推测为属于糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶。将bgl基因克隆并构建了重组表达载体pGEX-bgl,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导获得表达。重组蛋白经亲和层析纯化后,以七叶苷为底物进行了酶学分析,结果表明该酶的最适温度是45℃,最适pH在5.5~6.0之间,对七叶苷的Km值为17.7 mmol/L。该酶在pH 4~7范围内稳定;70℃保温2 h后仍能保持60%的活性。金属离子和化学试剂对酶活性有不同程度的影响,Ca2+对重组酶有轻微的激活作用,而SDS可强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高,为进一步的研究与应用奠定了基础。     

棘孢曲霉SM-L22β-葡萄糖苷酶的纯化与性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

新型海洋微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及重组酶性质

通过功能筛选方法,从中国南海海洋表层海水微生物元基因组文库筛选得到了6个β-葡萄糖苷酶阳性克隆。对其中的一个阳性克隆pSB47B2进一步亚克隆和序列分析,获得一新型β-葡萄糖苷酶基因(命名为bgl1B)开放阅读框。以pET22b(+)为载体、Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌,bgl1B被高效活性重组表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化了重组Bgl1B(rBgl1B)。纯化的rBgl1B催化pNPG水解反应的最适pH为6.5,最适温度为40oC。在最适反应条件下,rBgl1B水解pNPG的活性达到39.7U/mg,Km和Vmax分别为0.288mmol/L、36.9μmol/min。纤维二糖是rBgl1B的有效作用底物,其Km和Vmax分别为0.173mmol/L、35μmol/min。但rBgl1B不能催化转化蔗糖、乳糖、麦芽糖以及CMC。rBgl1B催化pNPG的水解反应对高浓度的Na+有较好的耐受性,而低浓度的Ca2+、Mn2+对该酶活有一定促进作用。不同于许多来源于真菌的酸性β-葡萄糖苷酶,rBgl1B在pH7.0～9.0范围内具有比较高的酶活力并具有较好的稳定性。     

绿色木霉耐热β-葡萄糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

旨在对绿色木霉-葡萄糖苷酶进行分离纯化并研究其酶学性质。对绿色木霉GIM3.139进行摇瓶发酵,经离心超滤和Sephadex G-200凝胶层析,得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。结果显示,分离纯化组分经PAGE电泳检测达到电泳纯,研究发现,该酶最适反应温度为80℃,热稳定性好,在70-95℃时能长时间保持较高活力,最适p H值为6.5,耐酸碱稳定性好。金属离子中,Fe3+、Mg2+、K+对β-葡萄糖苷酶的活性起抑制作用,其中Fe3+对该酶的抑制作用最为明显,Fe2+、Mn2+对β-葡萄糖苷酶的活性起激活作用,其中Mn2+对β-葡萄糖苷酶的激活作用最为明显。有机溶剂中,甲醇、丙酮对该酶起到激活作用,其中甲醇的激活作用最明显,而乙酸乙酯对该酶具有明显的抑制作用。分离纯化得到了电泳纯的β-葡萄糖苷酶,并掌握了其基本的酶学性质。     

棘孢曲霉SM-L22 β-葡萄糖苷酶的纯化与性质*

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

链霉菌GXT6 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及葡萄糖耐受性分子改造

【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。     

白蚁肠道元基因组来源高温β-葡萄糖苷酶Bgl17的酶学性质

【目的】对短角球白蚁(Globitermes brachycerastes)肠道元基因组文库中筛选得到的一个新型β-葡萄糖苷酶编码基因bgl17进行酶学性质研究。【方法】通过克隆与异源表达得到纯的Bgl17酶蛋白,根据Bgl17对底物的水解活性测定其稳定性及动力学参数,利用薄层层析确定其水解产物。【结果】该酶属于糖基水解酶第一家族(GHF1),对其特异性底物4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPGlc)的最适反应温度为70 °C,最适pH为5.0。在最适反应条件下,该酶以pNPGlc为底物比活力为115.69 U/mg,以水杨苷为底物比活力为297.39 U/mg。以pNPGlc为底物时,其动力学参数Km值和Vmax分别为0.81 mmol/L和227.27 μmol/(mL·min)。在稳定性方面,该酶在50 °C处理1 h仍可保持50%的活性,在pH 5.0和6.0条件下,该酶的半衰期为1 h。【结论】该酶在较高的温度下具有较高的活性,且对水杨苷水解活性高,这点不同于已知的β-葡萄糖苷酶,推测其更有利于木质纤维素复杂结构的降解;该酶的最适温度远高于白蚁生存环境温度,可为研究白蚁降解纤维素的机理提供参考。     

嗜热古菌Thermofilum adornatum来源的高温热激活β-葡萄糖苷酶TaBgl3的原核表达及酶学性质研究

【目的】β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，属于纤维素酶类，是一种降解纤维素的关键限速酶。来源于嗜热古菌的β-葡萄糖苷酶已被广泛验证具有酸性高温等特性，已成为高温酶的研究热点之一。本文对尚未报道的来源于嗜热古菌中一种热丝菌（Thermofilum adornatum）的GH3家族的葡萄糖苷酶，进行了原核表达和酶学性质测定，以期找到更优的β-葡萄糖苷酶。【方法】从NCBI数据库中获得了嗜热古菌（T.adornatum）来源的GH3氨基酸序列，构建重组质粒p ET-30a（+）-TaBgl3，并在大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达重组蛋白；采用磁珠纯化，研究其酶学性质。【结果】重组蛋白TaBgl3的分子量为77.0 kDa；酶学性质结果表明，其最适反应条件为80°C和pH 5.0，在70°C保温处理1–4 h，对TaBgl3的酶活力有促进作用，在最适温度80°C处理2 h后，其激活作用更加明显，能提高40%以上的酶活；其在pH 5.0–8.0下37°C保温1 h，仍具有60%以上的活性；底物为对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p NP...     

黑曲霉(Aspergillus niger)β-D-葡萄糖苷酶的纯化及其性质

利用垂直板凝胶制备电泳从黑曲霉(Aspergillus niger,AS 3.316)中分离提纯了β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21),经凝胶电泳鉴定为单一带。酶作用的最适pH为4.4,在pH4.0—6.2稳定;最适温度65℃,热稳定性较好,于60℃保温4小时,活力保留80％。此酶作用于纤维二糖的Km值为6.09mM。聚丙烯酰胺薄层等电聚焦测得其pI值为5.5;用SDS凝胶电泳测得其分子量为77000。此酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D-葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。金属离子Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Al~(3+)、Hg~+和Ag~+等对此酶有不同程度的抑制作用,蛋白质侧链修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺对此酶有较强的抑制作用,2-羟基-5-硝基溴苯对酶也有一定的抑制作用,推测色氨酸残基对β-D-葡萄糖苷酶的活力是非常必要的。     

一种不对称水解（R,S）-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新酯酶基因的克隆表达和酶学性质研究

本文将来自反硝化无色杆菌Achromobacterdenitrificans1104的酯酶基因EHest,转化大肠杆菌中,成功表达了具有不对称水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯( MAP )活性的酯酶EHesterase。用重组酯酶EHesterase催化MAP 的水解,底物浓度50 g/L,反应1h的转化率29.5%,产物( R-酸)的eep 是85.1%。该酶的最适反应pH和温度分别为9.0和50℃,在50℃以下和pH5~9之间具有较好的稳定性。该酶水解MAP 的米氏动力学参数Vm、Km 分别是0.733 g/(L·min)和7.49 g/L。加入10%DMSO对酶EHesterase的立体选择性和催化速度有一定的促进作用。 Cu2+、Fe3+对酶活有明显抑制作用。该酶水解MAP 的活性与水解p-对硝基苯乙酸酯的活性数量级相当,是水解橄榄油活性的333倍。     

贵州传统发酵豆制品中水解银杏黄酮苷的微生物β-葡萄糖苷酶筛选

[目的]微生物β-葡萄糖苷酶法水解银杏黄酮苷具有重要意义,不过目前这方面的研究极少。因此,本文目的是筛选到水解银杏黄酮苷的酶活高的微生物β-葡萄糖苷酶,并分析其底物选择性机制。[方法]以银杏叶提取物作为唯一碳源富集培养,从贵州传统发酵豆豉中筛选产对银杏黄酮苷水解酶活高的β-葡萄糖苷酶的菌株,并对该菌株进行鉴定。然后比较此β-葡萄糖苷酶对不同底物的选择性,同时测定此酶水解银杏黄酮苷反应的米氏常数Km及最大反应速率Vmax。最后,对不同的底物进行分子对接,分析其底物特异性机制。[结果]结果表明,筛选到的菌株GUXN01所产β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活最高,被鉴定为枯草芽孢杆菌。此β-葡糖糖苷酶对β构型的糖类以及苷类等具有广泛的底物特异性和不同的选择性,尤其对银杏黄酮苷具有很好的亲和性。分子对接研究表明枯草芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶对银杏黄酮苷和其他糖苷类具有不同亲和性和选择性的原因主要是酶结构和底物分子结构的相互作用力的差异导致的。[结论]这些发现为GUXN01所产的β-葡萄糖苷酶应用于水解银杏黄酮苷类生产相应苷元奠定了良好的基础。     

新型β-葡萄糖苷酶BglD2异源表达及水解虎杖苷能力

从海洋细菌Bacillus sp.D1中克隆、重组表达β-葡萄糖苷酶BglD2,研究其酶学性质,并对其水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力进行分析。BglD2的最适催化温度和pH分别为45℃和6.5,在30℃和pH 6.5条件下的半衰期约为20 h。BglD2能够水解含β(1→3)、β(1→4)、β(1→6)等键型的多种底物。BglD2具有良好的糖促活特性,100 mmol/L葡萄糖和150 mmol/L木糖分别将酶活力提升2.0倍和2.3倍。BglD2具有较好的乙醇促活及耐受特性,30℃时,10%乙醇使酶活力提升1.2倍,25%乙醇存在时其仍保留60%的酶活力。BglD2具有水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力,35℃条件下反应2 h水解率为86%。具有乙醇耐受及抗产物抑制等特性的β-葡萄糖苷酶BglD2在酶法水解虎杖苷制备白藜芦醇方面有应用潜力。     

重组根瘤农杆菌葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶性质

目前已发现的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶均来源于真菌, 尚无原核细胞来源的相关报道。从根瘤农杆菌LBA4404中克隆β-葡萄糖苷酶基因bg1, 将其构建在表达载体pET-28b上, 转化Escherichia coli RP (DE3), IPTG诱导表达。重组β-葡萄糖苷酶的比活高达36.7 μmol/(min·mg)。对经过Ni柱纯化的重组酶进行酶学分析发现: 该酶是糖基水解酶家族1的成员, 底物亲和力高, 专一性低, 在温度为40°C和pH在5-8之间时具有较高的酶活, 在低于40°C和pH 5-10之间时可稳定保存。以pNP-β-Glc为底物, 该酶的最适pH为6.4, 最适温度为60°C, 在37°C和pH 6.4的反应体系中, 该酶的Km为0.09 mmol/L, 竞争性抑制剂葡萄糖酸-δ-内酯和葡萄糖的Ki分别为0.03 mmol/L和75 mmol/L, 具有很高的葡萄糖耐受性, 当金属离子Ag+和Zn2+存在时, 酶活被明显抑制。该酶对pNP-β-Gal和pNP-α-Glc的Km分别为3.61 mmol/L和14.31 mmol/L。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的β-葡萄糖苷酶基因umcel3G 的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶.本工作分 6 次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库,获得 1.26×105个克隆,文库含外源 DNA 的总长度约为 4.8×106kb.从文库中筛选到118个表达β-葡萄糖苷酶活性的独立克隆.发现其中 8 个克隆表达的β-葡萄糖苷酶在pH5.0、37℃条件下活性较强.对其中一个克隆进行了亚克隆,序列分析发现一个 2223 bp 的潜在的编码β-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF),其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个β-葡萄糖苷酶同源性最高,具有 60%的一致性和73%的相似性.该ORF在 E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似,酶谱分析表明该表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性,证实该基因为一个β-葡萄糖苷酶基因.测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G 的酶学特性,其最适 pH 和最适温度分别为 6.0～6.5 和 45℃.一些金属离子如 Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如 Fe3+、Cu2+能抑制 Umcel3G 的活性.在 pH4.5、35℃和 5 mmol/L 的 Ca2+存在的条件下,用 Ni-NTA 纯化的重组酶的比活为 22.8 IU/mg,说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值.     

海枣曲霉β-半乳糖苷酶的催化性质

 通过测定海枣曲霉β-半乳糖苷酶的底物特异性,表明该酶水解对-硝基酚基β-半乳糖苷(PNP-β-gal)的活力最高。该酶水解PNP-β-gal,乳糖和对-硝基酚基β-D-岩藻糖苷(PNP-β-fuc)的相对活力为100,63.1,10.3。不同测定方法的结果均表明,这一PNP-β-fuc水解活性来自β-半乳糖苷酶本身。Hg~(2+)、D-半乳糖和D-半乳糖-r-内酯对该酶有强烈的抑制作用,Ag~+和4mol/l脲也有较强的抑制作用。该酶水解PNP-β-gal和乳糖的Km值分别为1.3及36.2mmol/l,Vmax则分别为478和189μmol.min~(-1).mg~(-1)。Lineweaver-Burk作图法及Dixon作图法均表明D-半乳糖和D-半乳糖酸-γ-内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为4和0.9mmol/l。