H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的进化分析

利用RT-PCR方法,扩增了1998～2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,对其进行了序列测定和进化分析.序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.4%～99.8%和93.6%～100%;9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失;进化分析表明,9株AIV属于A群,且形成一个独立分支,在该分支中,只有Ck/HN/A3/98株属于Ck/HK/Y280/97-like亚类,且与Ck/BJ/8/98的进化关系最近,其余8株属于Ck/SH/F/98-like亚类,说明Ck/SH/F/98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在.NS1基因的进化及其编码产物的特性分析,为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础.     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

山东地区16株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)山东分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术对16株从山东不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;有7～9个潜在糖基化位点;受体结合位点除198位有变异,其他位点均较保守;234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;16个分离株HA基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96.3%～99.9%和97.1%～99.6%;16个分离株同属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群。     

封闭式饲养鸡场H9N2亚型禽流感病毒HA基因在5年内的遗传变异

选择一个于1998年开始发生H9亚型禽流感的封闭式大型养鸡场,连续5年内分离到22株H9N2亚型病毒,对其中9株与1998年分离株进行HA基因序列和病毒抗原性的比较结果表明,这些分离株均与1998年的具有较高的序列同源性,且在本研究期内HA基因的这些变化尚未产生引起交叉保护性改变。初步推断这些分离株均系1998年分离株在场内循环传播变化得来,其HA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。这为进一步研究禽流感病毒变异的规律和制定正确的禽流感防治对策具有重要意义。     

家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒NS基因分析

对长沙市家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)的非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨污水中H5N1病毒的传播风险。9份家禽市场环境污水H5N1亚型AIV标本进行NS基因TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸(amine acid,aa)比对和进化树分析。共得到8个阳性克隆,进化树构建显示8个H5N1的NS基因均属于A亚群,其编码的NS1和NS2蛋白与A亚群代表株(A/chicken/Hubei/w h/1999)aa同源性分别为90.1%～92.5%和91.0%～92.6%,8个H5N1的NS1和NS2aa之间的同源性分别为93.8%～100.0%和98.4%～100.0%。8个H5N1的NS1蛋白均具有缺失80～84位aa、C末端携带有ESEV的PL基序和第92位aa为E的高致病性分子特征。家禽市场污水来源的H5N1亚型AIV的NS基因具有高致病性的分子特征,这种基因特征表明污水可能传播H5N1病毒。     

H9N2亚型禽流感病毒基因组全长序列测定和各基因的遗传分析

用RTPCR技术及cDNA末端快速扩增法获得禽流感病毒分离株A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）代表基因组全长的8个基因片段。基因组序列比较及遗传进化分析结果表明,Chicken/Shanghai/F/98的8个基因均不属于Quail/Hong Kong/G1/97亚系,与香港禽流感事件没有直接关系。它与Chicken/Beijing/1/94的HA、NA、M、NS基因同源率分别为96.7%、96.4%、97.5%和98.0%,这4个基因属于Chicken/Beijing/1/94亚系,其中,NA基因与Duck/Hong Kong/Y280/97的同源率为97.4%,而且它们均在205位后缺失9个核苷酸。而PB2、PB1、PA和NP基因与已知的3个亚系关系较远,分别在相应的进化树上另成分支。因此,Chicken/Shanghai/F/98是两个以上不同基因亚系间发生自然重排的产物。     

抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒NA基因的变异

将LG1株H9N2亚型禽流感病毒在带有抗LG1株母源抗体的鸡胚中分4个独立系列连续传40代后,有3个系列从10～20代起在NA基因的#99位发生了可稳定遗传的碱基"G"到"A"的突变,并使氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸;有2个系列从20～30代起在#473位发生了可稳定遗传的由"A"到"G"的碱基突变,导致相应的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸,另一个传代系列在50代时也发生了同样的突变。在无抗体的鸡胚上的2个独立对照系列同样传了80代,在这2个位点没有发生突变,表明这2个突变与抗体的选择压相关。在抗LG1母源抗体阳性鸡胚的连续40代传代过程中,NA基因在有抗体组的四个传代系列碱基的非同义突变(NS)与同义突变(S)比为4.6(32/7),而在无抗体组NS/S比为2.0(16/8)。有抗体组NS/S值显著高于无抗体组,也显示出抗体的选择压作用。     

H9N2亚型AIVHA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1基因的克隆及其序列分析

目的：克隆H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并分析其序列特性。方法：通过RT-PCR方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并对该基因片段进行测序,将此序列与数据库中不同时间、地点、宿主来源的H5N1亚型流感毒株NS1基因序列进行同源性比较。结果：获得了678bp的NS1全长基因,可编码225个氨基酸;其与毒株A／chicken／Jilin／hq／2003的同源性最高,二者的核酸和氨基酸的同源性分别为99．7％和99．1％。比对分析发现,该毒株NS1基因在第238-252位有15个核苷酸的缺失;进化树分析表明,它与1997年香港流行的H5N1亚型禽流感病毒毒株分别属于2个不同的分支。结论：克隆了一株H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并初步分析了其序列特性,为进一步研究NS1基因的功能奠定了基础。     

用基因疫苗制备H9亚型禽流感病毒单克隆抗体

用H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因反转录cDNA第一链PCR扩增其HA基因,PCR产物与pcDNA3.1( )质粒构建重组质粒作为基因疫苗免疫8周龄Balb/C小鼠,细胞融合后用血凝抑制试验(HI)和ELISA试验检测细胞培养上清,各获得一株阳性细胞株,经3次亚克隆后都能稳定分泌H9AIV特异性抗体。特异性检测与NDV、H5亚型AIV、产蛋下降综合症(EDS76)病毒毒株没有反应,2株单抗经亚型鉴定均为IgG2b,轻链的亚型为kappa链。所获得的单克隆抗体将在禽流感快速诊断和疾病预警监控中发挥重要作用。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因(na)序列设计、合成克隆引物.自H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增na基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTM pET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组神经氨酸酶,分子量约53.8kDa.分析重组NA的免疫反应性和免疫原性,结果表明重组NA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免异动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性.     

H9N2亚型AIV HA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物, 用PCR方法从重组质粒pUC-HA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因 , 将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中, 构建原核表达载体pET-HA.阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA基因获得表达, 经定位分析, 目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中.通过改变IPTG的浓度和诱导时间, 确定了表达HA基因的最佳诱导条件 IPTG 终浓度为0.7mmol/L , 诱导时间为3 h .Western-blot分析表明, 重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应.以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法.结果表明, 抗原的最佳包被浓度为25μg/mL, 血清的最佳稀释度为180, 阳性标准初步定为 OD待检血清＞0.5且OD标准阳性血清＞1.0 ; OD标准阴性血清＜0.1.     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因(na)序列设计、合成克隆引物。自H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增na基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组神经氨酸酶,分子量约53.8kDa。分析重组NA的免疫反应性和免疫原性,结果表明:重组NA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免异动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因, 将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA1基因获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 , 确定了表达HA1基因的最佳诱导条件: IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为3h。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为4μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶200, 阳性标准初步定为：OD待检血清＞05,且 OD待检血清/OD阴性血清＞2。     

上海地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析

为阐明上海地区 H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异、分子特征和重组模式,选取2002和2006～2014年分离自活禽市场、家禽养殖场和生猪屠宰场的14株 H9N2亚型禽流感病毒进行分析。这14株病毒分别来源于鸡、鸭、鸽、野鸡咽喉和泄殖腔样品及猪肺脏样品,用 H9亚型荧光反转录‐聚合酶链反应（RT‐PCR）试剂盒检测后,阳性样品经无特定病原体（SPF）级鸡胚尿囊腔接种并分离病毒,用血凝抑制（HI）实验进一步确定其血凝素（HA）亚型。RT‐PCR分别扩增这14株病毒全基因并进行序列测定,分析8个基因片段的遗传发生关系,发现这些分离株主要由 F／98亚系、Y280亚系、G1亚系及未知亚系重组而成。根据8个基因片段的组合情况,这14株病毒可分成5个基因型。2002、2006～2008年分离的5株H9N2亚型禽流感病毒代表了4个不同基因型,2009～2014年分离的9株H9N2亚型禽流感病毒属第5种基因型,推测可能与疫苗免疫选择压力有关。因此,在以后工作中加强H9N2亚型禽流感分子流行病学监测是非常必要的。     

表达H9亚型禽流感流毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RT－PCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒（AIV）分离株（A／Chicken/China/F/1998)的血凝素（HA）基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7．5的下游,得到重组转移载体1175HA,以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞（CEF）中,通过在含X－gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-HA,以间接免疫荧光法证实感染rFPV-HA的CEF表达了HA,rFPV-HA在免疫7日SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制（HI）抗体,14天后诱生的HI抗体能达到高峰,且诱生的HI抗体保护较高水平达55天,在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行了免疫效力试验表明,rPV-HV能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

抗体选择压作用下H9N2亚型禽流感病毒HA基因的变异

摘要：【目的】了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在抗体选择压作用下的遗传变异。【方法】将制备疫苗用的LG1株H9N2亚型AIV分别接种含有母源抗体鸡胚(A组)和不含有母源抗体的SPF鸡胚(B组),并连续传代。其中A组再分为4 个独立的传代系列A1-4,B组再分为2 个独立传代系列B1-2。在每个传代系列,分别对第10,20,30,40,50 代病毒的HA基因进行扩增克隆测序,并与原始病毒的序列比较。【结果】LG1株H9N2在没有抗体的鸡胚的传代过程中,仅发生少数碱基的不稳定随机变异,且多为无义突变。在2 个传代系列的10 个代次病毒,共出现了29 个位点变异,有义突变(NS)与无义突变(S)比值NS/S为1.42 。但在有抗体的鸡胚的传代过程中,发生了多个呈现稳定遗传的有义突变。在4 个传代系列的20 个代次病毒,共出现了45 个位点变异,有义突变(NS)与无义突变(S)比值NS/S为3.46。【结论】在鸡胚传代过程中母源抗体提供的免疫选择压确实能影响H9N2的HA基因的变异。同时表明,带有母源抗体的鸡胚是实验室条件下研究免疫选择压对病毒抗原性变异影响的一种有效的实验模型。     

H9N2亚型禽流感病毒广东分离株的全基因克隆及序列分析

本研究以一株2006年广东省分离的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/HL/2006(H9N2)(简称Ck/GD/HL/06)为研究对象,用RT-PCR法扩增病毒基因组各片段(包括5′端和3′端的非编码区序列),将扩增片段进行克隆、测序并与参考毒株的相应序列进行比较分析,绘制各基因片段的系统发生树。分析结果表明,Ck/GD/HL/06株的HA基因同1997年中国香港鸭源毒株Dk/HK/Y280/97(H9N2)在同一进化分支,从HA的糖基化位点、受体结合位点等综合分析,该毒株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9亚型禽流感病毒的特点。HA的226位氨基酸残基为亮氨酸(Leu),具有同哺乳动物SAα,2-6受体结合的特性。Ck/GD/HL/06的PB1、PA和NP基因,同2004年越南分离的人源高致病性H5N1亚型流感病毒A/VietNam/1203/2004(H5N1)株(简写A/VN/1203/04)的核苷酸序列一致性分别是93.8%、95%和96.8%,在先前的研究中未见有类似特性毒株的报道,而这种特性H9N2亚型AIV的出现,是否会增加在重组过程中产生新的高致病性H5N1亚型AIV的可能性,是值得我们关注的一个问题,也提醒在我国华南地区应更加重视防控H9N2亚型AIV,做好长期对H9N2亚型AIV监控及分子流行病学调查的工作。     

提高H9N2亚型禽流感病毒的拯救效率条件的优化

目的:在原有的8质粒转染体系的基础上,提高H9N2亚型禽流感病毒8质粒转染的效率。方法:以脂质体细胞转染法,用293T细胞和MDCK细胞共转染A/Chicken/Jiangsu/SH14(H9N2)禽流感病毒的8个连接在PHW2000载体上的反向遗传质粒,并且NS片段携带有GFP绿色荧光基因。通过TPCK胰酶的浓度,DMSO,尿囊液的作用,以及转染后孵育时间来摸索出最佳的转染条件。转染后48h用倒置荧光显微镜检测绿色荧光,并计算出转染效率。结果:通过统计学分析结果可见,转染后8h,使用DMSO处理后再加入1ug/m L的TPCK胰酶,转染效率最高,绿色荧光表达的最多。结论:我们通过联合DMSO和TPCK的方法一定程度上提高了H9N2亚型禽流感病毒8片段转染的效率。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。