玉米逆境诱导型启动子克隆及其植物表达载体构建

设计特异引物,利用PCR方法从玉米(Zea mays)基因组DNA中克隆低温和盐相应蛋白(low temperature andsalt responsive protein,LS)基因上游1 735 bp,命名为Lsp。利用在线启动子预测工具PlantCARE分析表明,序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还包含各种胁迫响应元件。以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将克隆得到的启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体pCAM-Lsp,并用反复冻融法将其导入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转化烟草,GUS组织化学染色显示出Lsp驱动GUS基因表达。结果表明,该Lsp启动子片段具备一定的启动活性,为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。     

玉米AGPase基因启动子的克隆及鉴定

以玉米基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增得到了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase基因编码区上游1912 bp的启动子(AGPasep)序列.该序列包含TATA-box,CAAT-box等一些高等植物特有的启动子基本核心序列,推断其为一种新的启动子.为了验证该序列是否具有启动子功能,构建了含有此序列的植物表达载体pCAM-AGPasep,通过农杆菌介导法转化玉米愈伤组织进行瞬时表达.GUS染色结果表明,该序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子功能.     

玉米淀粉分支酶基因启动子的克隆与功能分析

以玉米品种“吉糯1号”的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到玉米淀粉分支酶基因的启动子序列,克隆到pMD18-TVector上,经测序,该启动子大小为934bp。与已报道的序列比较仅有14个核苷酸发生改变,同源性为98.5%。用该启动子取代植物表达载体pBI121的35S启动子,与GUS基因编码区连接,构建成融合质粒pSBE-GUS。经农杆菌介导法转化烟草,获得了转基因植株。GUS活性检测结果表明,由该启动子序列引导的GUS基因能在种子中表达,而在其他组织中表达微弱或未表达,证实该启动子具有种子特异性表达的功能。     

拟南芥根特异表达基因启动子在烟草中的表达

以拟南芥为材料,利用PCR技术分离pyk10启动子序列,构建了该启动子GUS植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,分析该基因在烟草中的表达,以明确拟南芥根特异表达基因pyk10启动子在烟草中的表达特性.结果表明:克隆的pyk10启动子与已报道的pyk10启动子一致性为100%,GUS基因在烟草的根部特异表达,表明该启动子为根部特异表达启动子,为揭示植物根的发生、分化和发育机制,以及培育抗根部病虫害和营养高效利用型转基因烟草奠定了基础.     

玉米脱氧麦根酸分泌通道蛋白基因YS3启动子的克隆与启动活性分析

缺铁是世界范围内农业生产面临的严重问题,玉米通过分泌脱氧麦根酸(2’-deoxymugineic acid, DMA)吸收利用土壤中的难溶性铁。为探明玉米DMA分泌通道蛋白基因YS3的表达和调控机制,本文通过克隆获得长为2813 bp的YS3基因启动子,该序列含有大量TATA-box、CAAT-box等启动子基本元件,以及光响应、激素调控等多个顺式调控元件;构建YS3启动子驱动GUS基因的植物表达重组载体pCAMBIA-YS3GUS,利用农杆菌介导转化拟南芥,获得pYS3::GUS转基因植株,对转基因植株进行GUS组织化学染色,并通过石蜡切片技术对转基因植株进行组织观察,分析pYS3::GUS转基因植株中YS3基因启动子的活性。结果表明,YS3启动子主要驱动GUS基因在拟南芥根部表达,且主要集中在根部表皮细胞,机械损伤可激发YS3启动子活性,驱动GUS基因在损伤临近部位表达。本研究对于理解玉米DMA分泌的分子调控机理方法od3 gmaigensuan有重要意义。     

甘蓝型油菜BcNA1基因启动子在转基因烟草中对GUS基因表达的调控

通过PCR扩增,从甘蓝型油菜（Brassica napus)品种H165中克隆了种子贮藏蛋白基因BcNAl的启动子,将此启动子与GUS基因相连构建了植物表达载体,利用农杆菌介导法将其导入烟草,对转基因烟划GUS基因检测分析表明,BcNAl基因启动子能特异地启动GUS基因在种子中的表达;而且GUS酶的活性随着转基因烟草种子的发育而变化。同时还间接证明BcNA1基因的启动子在转基因烟草中的遗传传递方式符合盂德尔遗传定律。     

草莓MET1基因启动子克隆及瞬时表达分析

根据草莓MET1类DNA甲基转移酶基因(FaMET1)全长序列设计引物,通过PCR获得了该基因翻译起始位点上游669 bp的序列.生物信息学分析表明,该序列中存在启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box和多个胁迫诱导元件.进一步构建了FaMET1基因启动子驱动GUS的植物表达载体FMpro::GUS,通过农杆菌注射法转化草莓果实细胞,结果表明,该序列能够驱动GUS在草莓果实中瞬时表达,为进一步研究FaMET1的表达调控奠定了基础.     

白桦CESA7基因启动子的克隆与表达分析

克隆得到了一个白桦纤维素合成酶基因（CESA7）GenBanK登录号（EU591531）启动子序列,通过序列分析发现该启动子含有多个不同功能的顺式作用元件,包括光响应元件、激素响应元件、叶片形态发育元件等,推测该启动子在白桦生长发育过程中具有关键作用。将BpCESA7启动子克隆至带有GUS报告基因的植物表达载体,命名为proBpCESA7-121-GUS,并利用农杆菌介导方法侵染白桦和拟南芥,然后通过GUS组织化学染色观察BpCESA7基因启动子的组织表达特性。结果在白桦的根、茎、叶和拟南芥的根,叶,萼片、雌蕊中检测到了GUS活性,说明BpCESA7基因启动子具有启动子活性,并且在白桦的根和叶中染色最深,表明BpCESA7基因在白桦根和叶中表达量较高,并且其存在组织表达特异性。     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

中南民族大学生命科学学院李静、刘学群和王春台3位科研工作者利用从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因（GT—like）,通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5’端-1150～0上游调控区,经序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT—Like基因启动子与gus报告基因连接,构建植物表达载体pGT-gus,经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明：     

白桦APETALA2基因启动子的克隆及其表达分析

APETALA2（AP2）转录因子亚家族普遍存在于植物中,参与植株的生长发育、胁迫应答和多种生理生化反应的信号传导。本研究从白桦（Betula platyphylla Suk.）基因组中克隆了AP2基因2 308 bp的启动子序列,生物信息学分析发现,该序列除具有TATA-box和CAAT box等高等植物普遍具有的保守元件外,还具有大量光响应元件和激素响应元件,如响应赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯等的元件。将白桦AP2基因启动子克隆至pBI121-35S：：GUS植物表达载体中,命名为pBI121-proAP2：：GUS,用农杆菌介导法侵染白桦和拟南芥,并进行GUS染色分析,结果表明AP2基因启动子驱动下的GUS报告基因在整个拟南芥中都表达,在白桦的营养器官和雌花种翅及花柄中也有表达,说明其具有启动活性,可能参与该器官的发育。     

水曲柳节律基因LHY启动子的克隆和功能分析

以水曲柳基因组DNA为模板,用Site Finding-PCR法扩增得到节律基因LHY（late elongated hypocotyl）启动子序列,长度为1 360 bp。PLACE启动子预测工具分析表明,序列中含有转录必备的TATA box、CAAT box以及一些非生物胁迫和激素响应元件等。构建植物GFP瞬时表达载体p PXGFP-P-LHY,农杆菌介导转化烟草叶片和白桦悬浮细胞,GFP检测结果表明,LHY启动子能够启动GFP基因在烟草和白桦细胞中表达,且对非生物胁迫（低温、高温、盐）产生响应;构建植物GUS报告基因整合表达载体p PCXGUS-P-LHY,农杆菌介导法瞬时转化烟草,GUS染色结果表明,LHY启动子的活性具有不同程度的时空特性。     

拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列克隆及其活性分析

目的:克隆拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列,并分析其组织器官特异性及对外界刺激的响应.方法:通过PCR从拟南芥基因组中克隆AtNCED2基因5'侧翼2295bp启动子区域序列(AtNCED2p),并进行生物信息学分析.构建AtNCED2p驱动GUS的植物双元表达载体pAtNCED2p::GUS,通过根癌农杆菌介导法将其转化野生型拟南芥,检测转基因植侏中GUS表达的组织器官特异性.结果:该启动子序列中存在TATA-box、CAAT-box、根器官特异性元件、ABA响应元件、低温响应元件、昼夜节律响应元件等顺式作用元件.GUS活性主要集中在转基因拟南芥根尖及侧根发生部位.外源ABA处理的转基因植株根中GUS活性为174.8nmol 4-MU min-1 mg-1蛋白,明显高于对照值91.7nmol 4-MU min-1mg-1蛋白.结论:AtNCED2基因可能在根的生长和发育中起作用,且外源ABA处理增强其在根中的表达.     

玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因的启动子克隆与功能验证

该研究在生物信息学分析的基础上,克隆玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因(MGL3)的启动子序列(pMGL3),进行非生物逆境应答元件分析以及实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性,构建了pMGL3启动子驱动报告基因(GUS)表达载体,基因枪法转化玉米愈伤组织,通过GUS染色验证pMGL3启动子在非生物逆境胁迫下的驱动活性。再根据启动子序列分析结果,去除不同的顺式作用元件,构建不同长度pMGL3启动子驱动报告基因GUS表达载体,农杆菌介导法转化烟草叶盘,以确定pMGL3启动子的最短活性序列。结果显示:pMGL3启动子长1 554bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,在干旱、高盐、低温胁迫及脱落酸、乙烯诱导下驱动MGL3基因增量表达,用以驱动GUS基因转化玉米愈伤组织,在高渗、高盐、低温胁迫及脱落酸诱导下具有驱动活性,且截短至325bp仍可保持驱动活性。研究表明,pMGL3启动子的确有非生物逆境诱导启动活性,进一步验证其作用机理后可运用于玉米抗逆转基因研究。     

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）病程相关蛋白基因（PR-1）序列设计引物,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到水杨酸诱导表达的PR-1基因启动子片段,序列分析表明,该启动子含910bp核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．7％：将该启动子构建到植物表达载体pB1121上,获得病程相关蛋白基因（PR-1）启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体pBI-prlp,将其转入根癌农杆菌GV3101,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究寄主-病原物相互作用的分子机理奠定基础。     

油菜(Brassica napus)Bna-miR1140基因启动子miR1140Pro的克隆与表达模式研究北大核心CSCD

旨在研究Bna-miR1140的表达模式及其调控机理,依据本实验室前期的油菜miRNA芯片实验结果,从油菜栽培种Westar中克隆了Bna-miR1140前体序列上游1.5 kb的片段,并进行了顺式作用元件分析,然后构建了GUS报告基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将miR1140 pro∷GUS转化到甘蓝型油菜Westar品种中,经PCR法鉴定获得5株阳性株。对阳性株油菜T1代各组织的GUS化学染色分析表明,miR1140前体序列上游1.5 kb区域具有启动子的功能,能够驱动GUS在油菜中表达,并且GUS基因仅在叶柄及叶腋中特异性表达,说明油菜miR1140Pro为特异性启动子。     

番茄果实特异性启动子的克隆与遗传转化研究

为了实现外源基因在番茄果实中的高效和特异表达,克隆了番茄果实特异基因多聚半乳糖醛酸酶基因( Polygalacturonase,PG)的启动子.以中蔬四号番茄为材料,建立并优化了以子叶为外植体的番茄高效再生和遗传转化体系;以GUS为报告基因,构建PG:GUS植物表达载体,转化番茄.结果表明,在1.0 mg/L ZT的MS分化培养中,番茄子叶的发芽率最高,芽的诱导率高达91％,且发生畸态芽和褐化的外植体最少;通过抗生素浓度对农杆菌的抑制效果试验发现,当头孢霉素的浓度为200 mg/L时,抑制农杆菌的效果最好;成功克隆了番茄PG启动子,将PG启动子驱动的GUS基因转入番茄,对转基因后代果实的GUS染色表明,PG启动子驱动的外源基因在果实中特异表达.     

獐茅HAK基因表达调控区的分离及其在水稻中的功能分析

獐茅高亲和性K+转运蛋白基因(AlHAK1)是从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆,对于细胞营养和离子渗透调节起关键作用。为了进一步了解AlHAK1基因的表达调控机制,文章采用基因组步移法分离了AlHAK1基因转录起始位点上游长度约1.3 kb的启动子区域。启动子顺式元件分析显示该序列具有典型的TATA和CAAT盒,以及一些与植物生长发育和环境响应相关的顺式元件。为了明确AlHAK1启动子的功能,将其与GUS基因融合构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,通过农杆菌介导转化法导入水稻中。对转基因植株进行GUS组织化学染色,结果显示在转化AlHAK1启动子水稻的根、茎、叶、花药和内外稃部位均检测到GUS活性。GUS荧光定量分析显示AlHAK1启动子调节GUS表达活性低于组成型启动子CaMV35S和Ubiquitin,但其根部和茎部的GUS活性相对较高。对转化植株进行不同胁迫处理后检测GUS活性,结果表明受到ABA、干旱、高温的诱导后其茎部和根部GUS活性有所提高,推测位于该启动子-682 bp的HSE元件和-1 268 bp的MybBS元件可能在高温、ABA和干旱诱导的表达调控中起作用。     

油菜(Brassica napus)Bna-miR1140基因启动子miR1140Pro的克隆与表达模式研究

旨在研究Bna-miR1140的表达模式及其调控机理,依据本实验室前期的油菜miRNA芯片实验结果,从油菜栽培种Westar中克隆了Bna-miR1140前体序列上游1.5 kb的片段,并进行了顺式作用元件分析,然后构建了GUS报告基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将miR1140 pro∷GUS转化到甘蓝型油菜Westar品种中,经PCR法鉴定获得5株阳性株。对阳性株油菜T1代各组织的GUS化学染色分析表明,miR1140前体序列上游1.5 kb区域具有启动子的功能,能够驱动GUS在油菜中表达,并且GUS基因仅在叶柄及叶腋中特异性表达,说明油菜miR1140Pro为特异性启动子。     

两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析

启动子的克隆对基因表达及基因工程研究有重要意义。根据数据库中EST丰度,从水稻中克隆了两个预测在水稻胚乳中高效表达的启动子Os772和Os359,并将启动子片段与GUS报告基因融合,构建了重组表达载体。通过农杆菌介导方法将其导入水稻愈伤组织细胞。转基因水稻经GUS组织化学分析显示,Os772和Os359能启动GUS基因在水稻胚乳中表达但不能在根、茎、叶和花中表达。该结果表明Os772和Os359为两个水稻胚乳特异性启动子。     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达

以玉米(Zea mays L.)黄化苗为材料,利用PCR技术扩增了玉米19kDa醇溶贮藏蛋白基因(zein)起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的-1～-694片段具有19kDa zein启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达90％以上。将此启动子插入pPKGT的GUS基因及NOS终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草(Nicotiana tabaccum Var.samsum),得到了转化植株。转化的烟草的PCR扩增及Southern杂交证明目的片段已整合到烟草基因组中。转基因植株的GUS活性检测表明,在叶、根中无GUS活性,GUS活性只存在于种子中。转基因植株烟草种子经冷冻切片,GUS底物Xgluc活体组织染色证明GUS活性只存在一层介于种子胚乳与种皮之间的细胞中。