转基因小鼠

转基因动物是动物基因工程在医学和农业生物学研究中突出的成果。转基因动物在近十年中已取得很多成果,并为研究分子遗传学、发育生物学、医学遗传学提供了许多宝贵的资料,为研究肿瘤病因学及家畜育种开拓了新的途径。     

绿色荧光蛋白嵌合体小鼠的建立和鉴定

为研究嵌合体动物中供体胚胎干细胞 (ES)在宿主胚胎发育中的走向和定位 ,同时探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值 ,本研究将pEGFP N1基因导入小鼠ES D3 细胞系 ,得到稳定表达GFP的胚胎干细胞亚系ES D3 GFP ,通过对昆明小鼠的囊胚腔注射 ,获得了 4只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠。其中 1只存活至成年 ,3只出生时死亡。荧光显像及组织PCR检测显示了绿色荧光蛋白在小鼠体内的嵌合情况。以绿色荧光为指标可实现活体水平的动态观察 ,本实验首次观察到以GFP为指标所示的机体嵌合情况与根据毛色嵌合推测的机体嵌合情况存在很大差异 ,以GFP为嵌合指标更加全面而准确 ;但不排除GFP对小鼠发育存在一定毒性的可能 ;另外 ,有结果显示供体ES细胞在宿主体内除了大片补丁状嵌合外 ,还存在细胞散在嵌合的情况 ,后者提示了在组织中利用GFP对ES细胞实施单细胞追踪和实时观察的可行性 ,为胚胎发育和疾病发生的相关研究提供了新的观察方法     

转基因动物的基因定位整合

一导言对哺乳动物基因组进行人为的改造,从而得到人们所期望的具有目的性状的新的种系,这是哺乳动物遗传工程学界长期为之努力的目标。目前,转基因动物的构建工作已取得很大的进展,但是要得到进一步的发展,有待于在两个环节上的突破。 首先,是如何得到基因操作的稳定结果。因为无论采用哪种基因导入方式,人们都无法控制外源DNA在进入受体细胞以后的行为。     

EGFP小鼠ES细胞来源的生殖系嵌合小鼠的获得和鉴定

生殖系嵌合体的获得是实现ES细胞介导的转基因途径的决定步骤,而嵌合体的制作及生殖系嵌合体的获得则是判定ES细胞系是否具有配子分化能力的有效方法。利用一株表达绿色荧光蛋白的杂种ES细胞系制备出嵌合体小鼠,共获得9只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠,其中有8只雄性, 1只雌性,目前均发育成健康成年小鼠。流式细胞检测显示了绿色荧光蛋白在嵌合鼠以下器官的表达情况:心(77.96±15.78) %、脾(84.06±3.60) %、肾(42.49±19.79) %、骨髓(52.02±18.78) %。昆明雌鼠与雄性嵌合鼠杂交1代(F1)毛色表型分析显示该株ES细胞具有生殖系嵌合能力。     

显微注射法制备转基因小鼠的技术研究

转基因技术是发生工程学或胚胎操作技术中的一部分。这一技术包括有受精卵的采集,受精卵的体外培养,胚胎移植等技术,转基因动物制作是其应用技术之一,它是将外源ＤＮＡ片段用显微注射法直接注入受精卵原核,使外源ＤＮＡ随机整合到寄主基因组中而形成转基因小鼠。我们建立完善这一技术的目的是在实验动物的生产中为转基因动物的生产提供稳定可靠的保证。我们将ｐＣＸＴＧＡＰ、ｐＣＳＬＮ等基因分别注入受精卵原核制备相应的转基因动物模型,并从中总结较佳的操作技术。结果经检测阳性转基因小鼠占出生幼鼠的１６３８％。我们认为不仅要有精细的微注射技术、动物的选用和饲育、严密的胚胎操作都是转基因动物制作成功的重要条件。     

EGFP小鼠ES细胞来源的生殖系嵌合小鼠的获得和鉴定

生殖系嵌合体的获得是实现ES细胞介导的转基因途径的决定步骤，而嵌合体的制作及生殖系嵌合体的获得则是判定ES细胞系是否具有配子分化能力的有效方法。利用一株表达绿色荧光蛋白的杂种ES细胞系制备出嵌合体小鼠，共获得9只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠，其中有8只雄性，1只雌性，目前均发育成健康成年小鼠。流式细胞检测显示了绿色荧光蛋白在嵌合鼠以下器官的表达情况：心(77.96±15.78)%、脾(84.06±3.60)%、肾(42.49±19.79)%、骨髓(52.02±18.78)%。昆明雌鼠与雄性嵌合鼠杂交1代（F1）毛色表型分析显示该株ES细胞具有生殖系嵌合能力。     

转基因植物及其安全性

所谓转基因植物,是指运用DNA重组技术将外源基因整合到受体植物基因组中,从而改变其基因组成,这种基因组结构发生改变的植物及其后代就是转基因植物。1983年,世界上第一株转基因植物,是由美国科学家研发出来的转基因烟草。1986年首批转基因作物被批准进行小规模田间试     

基因打靶突变小鼠与基因功能研究

ES细胞是建立基因打靶突变小鼠的必要条件 ,也可用于制备转基因动物 .基因敲除、精细突变和条件性基因打靶技术建立的基因打靶突变小鼠在人类遗传病机理研究、基因治疗和基因功能研究方面都有着重要作用 .     

通过ES细胞途径获得转基因小鼠的新方法

本文介绍一种简单、有效地通过ＥＳ细胞途径来获得转基因小鼠的新方法。     

Mx—cre转基因小鼠品系的建立及其培育

将携带MX启动子调控的Cre基因真核表达载体pMx-cre线性化后,通过受卵显微注射途径制备转基因小鼠,共注射99个卵,产佴0只,利用PCR对小鼠进行筛选,以基因组Southern blot确证,最后得到一个阳性的小鼠品系,进而将其保护和扩大繁殖。     

转基因小鼠中外源基因遗传及表达稳定性的研究

挑选两个乳汁中人凝血因子IX（hFIX）表达量相差较大的转基因小鼠家系,分别用PCR、Southern blot、FISH和ELISA对两个家系中的小鼠进行检测。结果显示后代小鼠的转基因阳性率为50%左右;外源基因的整合是完整的,没有发现可见的丢失现象;家系中的各个小鼠表达量有差异,FIX-33家系中hFIX在乳汁中的表达量为（43.32±5.41）?g/mL;FIX-124家系中hFIX在乳汁中的表达量是（1.16±0.45）?g/mL。而两个家系之间的表达量则差异极为显著(P<0.01)。这表明原代转基因小鼠的遗传及表达特性可以得到稳定的传递。     

染色体外同源重组结合细胞质注射途径研制转基因小鼠

以绵羊β-乳球蛋白基因(B—Lactoglobulin,β-LG)为转基因表达框架,将人G-CSF,(Human Granulocyte Colony Stimulating Factor,4G-CSF)基因与报告基因一增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescenct Protein,EGFP)基因作为双表达单元拼接到口β-LG基因的第一外显子处,并在G-GSF基因两侧引入同源重组位点loxP、fox2272,将打靶基因表达构件β-LG-hG-GSF-IRES-EGFP(总长9．3kb)分为两段进行构建,片段Ⅰ(长5．9kb)与片段Ⅱ(长5．6kb)两段重叠部分为2．2kb。向小鼠受精卵细胞质共注射构件片段Ⅰ、Ⅱ和NLS(核定位信号)3个基因片段。对仔鼠进行整合与表达的检测。PCR-Southem杂交检测结果表明,片段I的整合率为62．3％(86／138),片段Ⅱ的整合率为54．3％(75／138),片段Ⅰ、Ⅱ共整合(包括两片段分别整合和染色体外同源重组两种情况)的小鼠为62只,整合率为44．9％(62／138),其中在双阳性转基因小鼠中发生染色体外同源重组的几率为80．6％(50／62)。RT-PCR-Southem检测了10只发生染色体外同源重组的转基因雌性小鼠,hG-GSF基因的表达率为90％(9／10),EGFP基因的表达率为100％(10／10),通过对其乳汁紫外吸收光谱的检测,EGFP基因的表达率为50％(5／10)。上述结果表明,染色体外同源重组结合细胞质注射技术研制转基因动物是简便实用的转基因途径。     

ES小鼠和ES细胞中H19基因甲基化状态

为探讨印迹基因H19的甲基化状态与ES小鼠胚胎发育之间的关系, 以遗传背景相同的正常成年对照小鼠、22只成年ES小鼠和8只新生死亡的ES小鼠以及不同传代次数的ES细胞为实验材料, 利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR技术分别检测了其印迹基因H19的5′非翻译区两个位点的甲基化状态。结果表明, 发育至成年的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与正常成年对照小鼠之间没有差异, 而新生死亡的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠相比则存在明显差异。推测ES细胞中印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠之间可能存在 差异。     

外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性

转基因技术经过近半个世纪的发展,已成为当今生物技术研究的热点。近10多年来,与核移植技术的结合,转基因效率大大提高,携带有不同外源基因的不同种类的转基因动物迅速增加。但是,成功获得转基因动物并不是转基因动物研究的最终目的,如何利用转基因技术为人类的需求服务才是科研人员始终面对的课题。在畜牧生产领域,通过转基因技术培育家畜新品种是转基因技术应用的重要体现,在我国这方面已经引起了广泛关注。但迄今为止,外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性仍然是亟待解决的问题,究其原因,这主要与位置效应、外源基因的表观遗传学修饰和遗传效率相关,文章结合目前的研究进展和本实验室的研究结果,从这3方面阐述其作用机制,期望为转基因动物遗传育种向产业化的迈进提供一定的理论探讨。     

转基因小鼠和基因突变小鼠微卫星不稳定性分析

目的探讨微卫星在转基因和基因突变小鼠中的变化,为基因修饰和遗传突变动物的遗传检测和表型分析提供理论依据和技术手段。方法根据文献报道,从GenBank中选取198个等位基因数量多、富含多态性的微卫星位点,以野生型动物为对照,对6种近交系遗传背景的转基因小鼠和5种自然基因突变的近交系小鼠进行微卫星多态性检测,选用1.5%琼脂糖凝胶电泳和STR扫描技术,比较分析微卫星不稳定性。结果共有40个微卫星位点在转基因和基因突变小鼠中表现出多态性。在基因突变小鼠中,微卫星不稳定性有55.6%(10/18)是由纯合变为杂合(Ⅰ型),有3个位点(16.6%,3/18)是纯合突变(Ⅱ型),有5个位点同时存在2种类型的突变。但是在转基因动物中,大多数的微卫星多态性为Ⅰ型突变(87.5%,28/32),只有2个位点(6.2%,2/32)是Ⅱ型突变。另外有2个位点同时存在2种类型的突变。结论基因修饰或基因突变可引起小鼠相关微卫星发生不稳定性,而且某些微卫星位点对基因改变敏感性较高。     

动物转基因高效表达策略研究进展

外源基因在动物体内、细胞内表达时,常由于各种原因导致基因沉默。目前,主要有两种策略用于打破该瓶颈:一是利用友好位点;二是优化外源基因顺式作用元件。利用友好位点就是通过定点整合技术将外源基因插入至活性转录区域;优化外源基因顺式作用元件即采用合适的启动子、增强子、内含子、染色质开放元件、核基质附着区等元件,构建出高效表达载体。对相关策略进行概述,为动物基因工程育种提供参考。     

PiggyBac转座酶转基因小鼠模型的建立

目的 建立表达PiggyBac转座酶转基因小鼠模型,为研究PiggyBac转座子介导基因修饰在小鼠中的应用提供工具.方法 利用Cytomegalovirus( CMV)启动子驱动PiggyBac转座酶基因的表达,经显微注射法建立C57BL/6J表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测PiggyBac转座酶在小鼠生殖系睾丸中的表达情况.PiggyBac转座酶转基因小鼠活性的检测,是通过与转座子供体转基因小鼠杂交检测供体位置变化来确定的.结果 显微注射产生7只转基因小鼠并能传代,经RT-PCR筛选出一株在睾丸中相对高表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠.随后与转座子供体转基因小鼠杂交,子代双阳小鼠与野生型小鼠杂交基因型分离,产生的子代转座子供体单阳性小鼠中具有转座子供体片段的转座反应.结论 成功建立了表达PiggyBac转座酶转基因小鼠动物模型,该模型为PiggyBac转座子技术在小鼠中的应用提供了有价值的工具动物.     

转基因动物及其在生物反应器中的应用与市场现状

转基因动物是指用DNA重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内,使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内表达,且能稳定地遗传给后代的动物。1982年美国华盛顿大学Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里得到比正常体格大一倍的“超级小鼠”,此成果带动了转基因动物的一系列研究。