TIMP-2在毕赤酵母中的克隆与表达

为了克隆人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）基因,并在Pichia pastoris中表达,根据GenBank上的TIMP-2的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,通过化学合成和PCR相结合的方法获得了人的TIMP-2基因全长序列,构建了pPIC9-T2表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,并对表达产物进行了分离纯化和生物学活性分析。     

TIMP-2在毕赤酵母中的克隆与表达*

为了克隆人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)基因,并在Pichia pastoris中表达,根据GenBank上的TIMP-2的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,通过化学合成和PCR相结合的方法获得了人的TIMP-2基因全长序列,构建了pPIC9-T2表达载体,电击转化到毕赤酵母,通过表型筛选和诱导表达得到蛋白表达工程菌,并对表达产物进行了分离纯化和生物学活性分析。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

单纯疱疹病毒2型糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

构建单纯疱疹病毒2型包膜糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体,并对序列进行分析,为进行高抗原性的真核表达重组gD蛋白奠定基础。采用PCR扩增HSV2-gD成熟肽基因,将该段基因克隆于pGEM-T克隆载体,转化鉴定后,与巴斯德毕赤酵母表达载体(pPIC9K)酶切连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选测序确定构建了pPIC9K?gD的真核表达载体,对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性及抗原性。结果显示,获得的重组的酵母表达载体pPIC9K-gD,测序结果证实为HSV2-gD成熟肽基因,序列分析其高度保守,预测蛋白分子量40.63kD,等电点pI为7.15,包含完整成熟肽分值达1.7的多个抗原决定簇。成功构建了HSV2-gD成熟肽基因的毕赤酵母表达载体。     

α-2b干扰素重组质粒的建立及在毕赤酵母中的表达

目的:采用基因工程手段构建基因工程菌表达α-2b干扰素。方法:根据毕赤酵母密码子嗜好性原理设计并合成α-2b干扰素基因序列,将其插入到毕赤酵母Pichia pastoris的分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组分泌表达质粒pPIC9K-IFNα-2b,并用电转化法转化P.pastoris GS115。筛选出整合型His Muts菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,经5d诱导表达后SDS-PAGE检测。结果:菌落PCR和序列测定结果显示重组表达质粒已成功构建,SDS-PAGE结果显示目的蛋白已成功表达。结论:在毕赤酵母中成功表达α-2b干扰素。     

乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的表达和分离纯化

将乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因整合到质粒pPIC9K上,构建重组表达载体pPIC9K-coALDH2,用电转导将表达质粒pPIC9K-coALDH2转化至毕赤酵母GS115中,在毕赤酵母中表达经密码子改造的ALDH2。结果表明：重组基因工程菌GS115（pPIC9K-coALDH2）发酵液中蛋白质量浓度为8.40 mg/L,1 mL发酵液中酶活为11.35 mU。     

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut 表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。     

猪β防御素2成熟肽在酵母中的表达

【目的】将猪β防御素2成熟肽基因片段正确整合到酵母基因组染色体上,从而得到稳定的猪β防御素2成熟肽的毕赤酵母表达株。实现猪β防御素2成熟肽的表达。【方法】首先参考酵母偏爱密码子,设计3段引物序列,利用PCR技术扩增得到β防御2成熟肽基因,构建了重组质粒pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2。将线性化的重组质粒电转化到毕赤酵母KM71细胞中。最后筛选得到酵母阳性克隆,通过不断调节表达条件,实现猪β防御素2成熟肽的表达。【结果】将GST-pBD-2基因序列和pBD-2基因序列分别成功整合到酵母KM71基因组中,重组毕赤酵母工程菌构建成功;重组酵母蛋白GST-pBD-2和PBD-2都成功获得了表达;PBD-2成熟肽表达上清对猪霍乱沙门氏菌弱毒株C500有一定的抑制作用。【结论】获得表达pBD-2成熟肽的酵母菌株,本实验是用真核细胞表达pBD-2成熟肽的一次探索,为后续大量表达pBD-2成熟肽方法的研究打下了基础。     

黑曲霉Z6植酸酶基因phyA的克隆及表达

目的:克隆植酸酶基因phyA,构建毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母,并对重组工程菌的表达产物进行初步酶学性质研究.方法:以植酸酶高产菌株-黑曲霉Z6染色体DNA为模板,PCR扩增得到植酸酶基因phyA,序列鉴定后连接到毕赤酵母穿梭载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-phyA,电击转化毕赤酵母KM71,筛选得到重组转化子.对重组工程菌表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活性研究.结果:phyA序列分析表明该基因具有典型的植酸酶活性位点保守序列ArgHisGlyAlaArgTyrPro,与NC-BI已发表的植酸酶基因同源性较高,达到94%以上.该序列已提交GenBank,序列号为DQ318022.重组工程菌KM71-phyA7的PCR扩增证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中,植酸酶能有效分泌和表达,粗酶液酶活可达875U/mL.结论:植酸酶基因phyA在毕赤酵母中成功表达,为今后的定向改组奠定了基础.     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut 表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

Cloning and expressing a recombinant human tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) in methylotrophic yeast Pichia pastoris and its characterizations

To obtain human tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2)cDNA and the secretory expression of TIMP-2 gene in Pichia pastoris,we designed and synthesized a 618 base pairs artificial gene coding for the TIMP-2 with a computer-aided design method using a standard chemical synthesis technique,which was composed of frequently used codons in the highly expressed Pichia pastoris genes.Then the synthetic gene encoding TIMP-2 was checked by means of dideoxynucleotide sequencing.The verified gene of TIMP-2 was cloned to the Escherichia coli-yeast shuttle vector of pPIC9 to construct a recombinant plasmid pPIC9-T2.The plasmid was transformed into GS115 cells of the methylotrophic yeast,Pichia pastoris by electroporation,and we got the expression cell through phenotype selection and induction with methanol.Separation,purification,and bioactivity analysis of the expressed products were performed.     

巴斯德毕赤酵母表达系统中甘油阻遏相关基因GR1的分离克隆与鉴定

目的：分离克隆并鉴定巴斯德毕赤酵母表达系统中甘油阻遏相关基因。方法：PCR扩增LacZ基因,克隆至pPLC9载体,构建pPIC9-LacZ表达载体,经Sal I线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,构建GS115-LacZ模式菌株;用限制酶介导整合（REMI）技术使GS115-LacZ菌体基因组产生随机突变,筛选甘油去阻遏的GS115-LacZ△菌体;Southern blot鉴定GS115-LacZ△基因组,用质粒拯救技术和TAIL-PCR克隆未知基因序列并测序。结果：得到甘油去阻遏的GS115-LacZ△菌体,经Southern blot分析,突变仅发生在1个基因中;通过质粒拯救和TAIL-PCR,分离得到阻遏相关基因GR1,共2863bp,经在线BLAST,发现其编码一种过氧化物酶体自吞噬相关蛋白。结论：分离得到阻遏相关基因GR1,与过氧化物酶体自吞噬相关,提示过氧化物酶体自吞噬相关基因可能对醇氧化酶启动子AOX1的转录活性有影响。     

金针菇免疫调节蛋白基因fip-fve在毕赤酵母GS115中诱导型和组成型表达

为获得稳定来源并且具有生物学活性的重组金针菇免疫调节蛋白(Fip-fve),将fip-fve基因转至毕赤酵母GS115中进行诱导型和组成型表达。用PCR方法从金针菇子实体基因组DNA中扩增fip-fve基因,连接至pPIC9构建诱导型表达载体pPIC9-FIP-fve,从毕赤酵母基因组DNA中扩增三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pgap),替换pPIC9-FIP-fve上乙醇氧化酶启动子(paox1)构建组成型表达载体pPIC9-PGAP-FIP-fve。将线性化的两种表达载体用PEG法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺失培养基筛选和酵母菌落PCR鉴定后进行表达。结果表明,重组Fip-fve在以甲醇(1%,V/V)为碳源进行诱导型表达4 d达到最高,粗蛋白表达量为158.2 mg/L,在以葡萄糖(10%)和甘油(1%,V/V)为碳源进行组成型分别在表达第4天和第5天达到最高,粗蛋白分别为46.3 mg/L和29.5 mg/L。SDS-PAGE及Western blotting证明重组Fip-fve已正确表达,血细胞凝集活性检测初步证明重组Fip-fve具有良好生物学活性。     

乳酸菌素Gassericin T基因的人工合成及其组成型表达载体的构建

目的:为了研究乳酸菌素Gassericin T的作用机制及应用价值,人工合成Gassericin T基因并构建能高效表达外源蛋白的毕赤酵母组成型表达载体。方法:应用PCR方法从毕赤酵母染色体中扩增GAP启动子,经测序正确后与已线性化的不含pAOX1启动子的毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9K连接,转化大肠杆菌DH5α。根据Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA的密码子转换成毕赤酵母偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,人工合成gatA片段(简称gat基因),经测序正确后插入pGAP9K质粒的多克隆位点。结果:用GAP启动子(pGAP)取代了pPIC9K上的pAOX1,构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAP9K;PCR拼接获得250bp的目的基因序列,将目的基因克隆于pGAP9K,获得组成型表达载体pGAP9K-gat。结论:为下一步在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白,研究其作用机理和遗传机制奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒糖蛋白稳定型抗体精氨酸密码子突变株的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：对人源抗狂犬病毒糖蛋白（GPRV）单链二硫键稳定抗体（ScdsFv）进行精氨酸密码子修饰,实现其在酵母中的分泌表达,并检测其生物学活性。方法：参照巴斯德毕赤酵母偏好密码子,对抗GPRV ScdsFv原核表达基因进行密码子修饰,并通过点基因融合技术构建ScdsFv重组酵母表达基因,连接pPIC9K构建重组表达质粒pPIC9K-ScdsFv,电转化毕赤酵母GS115,经筛选后进行甲醇诱导表达。结果：SDS-PAGE及Western blot检测到重组表达质粒在30℃经甲醇诱导表达的蛋白相对分子质量为30000;荧光抗体试验验证ScdsFv能靶向结合GPRV;MTT试验说明ScdsFv能中和狂犬病毒,具有一定的细胞保护作用。结论：重组ScdsFv在酵母系统中可以有效表达。具有较好的生物学活性。     

甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU /mL,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

米根霉糖化酶、类芽孢杆菌木聚糖酶融合蛋白的真核分泌表达

以米根霉(Rhizopus oryzae)3.866基因组DNA为模板,克隆得到糖化酶基因(glucoamylase gene, amyA),基因全长2 049 bp,编码604个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出基因木聚糖酶基因(xylanase A gene, xynA)的成熟肽编码序列,长636 bp,编码211个氨基酸。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌AX11。在AX11发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(5.8 U/mL)和木聚糖酶活性(32.3 U/mL)。     

用毕赤酵母表达理氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因

目的:为提高β-葡萄糖苷酶的产量,用毕赤酵母取代理氏木霉用于生产,以弥补理氏木霉在大规模生产中的缺陷。方法:用套叠PCR法从理氏木霉基因组中扩增β-葡萄糖苷酶基因(bglⅠ)。用T4DNA连接酶和限制性DNA内酶将bglⅠ重组于P.pastoris表达载体pPIC9K的多克隆位点,获得含bglⅠ的重组表达载体pPIC9K-bglⅠ。通过电转法将其pPIC9K-bglⅠ载体转化于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性以及高表达bglⅠ酶的重组子作为工程菌。结果:用BMGY-BMMY培养基体系,在摇瓶中发酵48 h,表达BglⅠ30 mg/L,在P.pastoris中表达的BglⅠ能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷具有β-葡萄糖苷酶活性。其酶活力为56 U/L发酵液。结论:通过这种方法,可以成功地用毕赤酵母表达理氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因。     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.