检测中国对虾非包涵体型杆状病毒的PCR方法的建立

中国对虾非体型杆状病毒（ＰｃＮＯＢＶ）是中国大陆养殖的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）暴发性流行病－－白斑征的主要病原,与台湾流行的ＰｍＮＯＢⅢ、泰国的ＰｍＮＯＢⅡ及日本的ＲＶ－ＰＪ（＝ＰＲＤＶ）有相似的致病特征、形态学及组织病理学特征。为了角ＰｃＮＯＢＶ与ＰｍＮＯＢⅢ两种地域分布邻近的毒株基因水平的关系,并建立早期、敏感、特异的检测技术,利用氯化铯密度梯度超速离心技术分离纯化了ＰｃＮ     

分子信标探针用于PCR检测对虾白斑杆状病毒

将对虾白斑杆状病毒的一段特异性DNA设计成分子信标探针,用于该病毒的PCR检测.温度与荧光强度之间的关系表明,所设计探针的发夹既可以形成也可以打开,符合PCR对分子信标探针的要求.结果表明,在PCR同时加入分子信标探针不影响PCR扩增,分子信标探针只能与目的DNA杂交,具有较高的特异性.随着PCR循环数的增加以及含目的DNA的质粒拷贝数的增加,荧光强度都随之增强.     

中国对虾杆状病毒基因克隆及探针制备与检测

从收集的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）病虾样品中分离到一种杆状病毒,经负染在电镜下观察,完整病毒粒子大小为１１０×２８０～３２０ｎｍ。病毒核酸经ＥｃｏＲＩ酶切,克隆到ｐＵＣ１８质粒上,经筛选得到两个克隆Ｌ４６、Ｍ１３,克隆片段分别为２．１４ｋｂ和３．５８ｋｂ。将这两个基因片段和对虾白斑综合征杆状病毒（ＷｈｉｔｅＳｐｏｔＳｙｎｄｒｏｍｅＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ,简称ＷＳＳＶ）基因克隆片段Ａ２６制备探针,共同用点杂交法对我国沿海地区的病虾样品进行检测,以了解我国沿海地区对虾杆状病毒的分布,并确定中国对虾杆状病毒与ＷＳＳＶ的同源性。     

PCR制备地高辛素标记的探针检测轮状病毒核酸

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术,制备了轮状病毒第９基因部分片段的地高辛标记的ｃＤＮＡ探针。ＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交表明该探针具有轮状病毒Ａ组的特异性,可检出１０ｐｇＨＲＶ－ＲＮＡ。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交,两种方法的结果一致;同时将斑点杂交法与ＰＡＧＥ法的结果进行了比较。实验结果表明用ＰＣＲ技术直接制备地高辛索标记的ｃＤＮＡ探针具有方便、快速、标记率高、特异性强的特点,具有一定的应用前景。     

PCR制备地高辛素标记的探针检测轮伏病毒核酸

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术,制备了轮状病毒第９基因部分片段的地高辛标记的ｃＤＮＡ探针。ＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交表明该探针具有轮状病毒Ａ组的特异性,可检出１０ｐｇＨＲＶ－ＲＮＡ。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交,两种方法的结果一致;、同时将斑点杂交法与ＰＡＧＥ法的结果进行了比较。实验结果表明用ＰＣＲ技术直接制备地高辛素标记的ｃＤＮＡ探针具有方便、快速、标记率高、特异性     

热启动PCR快速制备地高辛标记探针

介绍了一种在热启动PCR中,以Dig-11-dUTP部分代替dTTP,从少量基因组DNA中快速制备大量的地高辛标记的探针的方法,此探针灵敏度达0.03pg,并只和相关的DNA特异杂交.     

中国对虾非包涵体杆状病毒在体内的感染与发生

在感染发病成虾的肝胰腺和中肠上皮细胞的胞核内,出现大量病毒发生基质,核衣壳,套膜和完全的病毒粒子。病毒粒子为短杆状,两端呈钝园形,平均大小约为２５０－３００×ｌ１０ｎｍ,在核内无包涵体形成。在胞质内发现伴随病毒拉子并具有双层膜的蛋白质结构,这种结构建议称为该病毒的“封入体”。同时,我们认为这种无包涵体的杆状病毒,有可能应归属于杆状病毒科的第三个亚组。     

中国对虾非包涵体型杆状病毒核衣壳的分离纯化

An effective procedure for isolation and purification of nucleocapsids of Penaeus chinensis non-occluded baculovirus (PcNOBV) which has destroyed the Chinese shrimp industry since 1993 was described. Gill, stomach, gut and cuticle epidermis under exoskeleton were excised from cultured P. chinensis diseased with typical white spot syndrome and homogenized in liquid nitrogen with TNE buffer containing PMSF and β-ME. The homogenized mixture was filtered through a 0.45μm millipore filter membrane to remove cell debris and ultracentrifuged to pellet the remaining material.The pellet was suspended in PMTNE buffer and laid onto a handmade CsCl gradient. An obvious viral band was observed in the middle of the gradient. Large amounts of virus nucleocapsids were visualized under electron microscope consistently corresponding to the milk-colored viral band. The viral envelope was all lost after purification. The nucleocapsid was bacilliform averaging 80±13nm×380±24nm in size. The negatively stained PcNOBV nucleocapsids revealed 13-16 conspicuous stripes located periodically perpendicular to the longitudinal axis of the nucleocapsids. Six to seven capsomers of 9 nm in diameter were visualized on each side of the stripe.     

地高辛标记DNA探针杂交法检测Vero细胞DNA残留量的适用性验证及应用

目的对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行适用性验证及应用。方法对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行特异性、灵敏度及稳定性验证,并应用该方法检测3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的DNA残留量。结果地高辛标记探针的标记效率为0.1 pg。验证结果显示探针与非同源DNA无杂交;最低检测限度为1 pg;探针在-20℃放置7个月后,检测灵敏度仍可达到1 pg;3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中残留DNA含量均符合《中国药典》规定质量控制标准。结论地高辛标记DNA探针杂交法特异性、灵敏度好,结果稳定,适用于人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他以Vero细胞为基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。     

PCR法检测对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒

皮下和造血器官坏死杆状病毒（ＨＨＮＢＶ）［１］、对虾杆状ＤＮＡ病毒（ＰＲＤＶ）［２］和白斑杆状病毒（ＷＳＢＶ）［３］是近年来引起全球对虾暴发性死亡的病原。这三种病毒同属杆状病毒属Ｃ杆状病毒亚群中的新病毒,在流行病学和病理学特征上十分类似,因此,我们...     

A new method for rapid screening of bacterial species- or subspecies-specific DNA probes

A simple assay for the rapid screening of bacterial species- or subspecies-specific DNA probes for the random cloning method is presented, involving the use of genomic DNAs as probes and recombinant plasmid DNAs containing genomic DNA digested with HindIII as targets. The optimal amount of target DNAs and the concentration of digoxigenin-labeled genomic DNA probes were 20 ng and 100 ng ml(-1) (or 10 ng and 200 ng ml(-1)), respectively. The method was applied to the development of Fusobacterium nucleatum subspecies-specific probes. Our results showed that four out of 96 probes were F. nucleatum subspecies-specific, which was confirmed by Southern blot analysis. Our results indicate that the new method can be used for the rapid screening of species- or subspecies-specific probes.     

原位杂交研究对虾白斑杆状病毒在虾体内感染过程

应用地高辛标记的对虾白斑杆状病毒（ｗｈｉｔｅ ｓｐｏｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ,ＷＳＳＶ）核酸探针,与人工感染后不同时间采集的对虾组织样品进行原位杂交,以动态研究病毒从侵染至对虾以病死亡的过程。将典型感染ＷＳＳＶ的病虾组织投喂健康对虾,结果显示：ＷＳＳＶ道德通过侵染消化道上皮进入虾体内增殖,此后随着细胞裂解、病毒粒子释放,游离的粒子伴随血淋巴循环进而杂其它靶组织,直至对虾发病死亡     

荧光素标记的庚型肝炎病毒基因探针的制备及应用

参考国内外已完成测序的庚型肝炎病毒（ＧＢＶＣ／ＨＧＶ）基因序列,选取毒株间系列较保守的基因片段,并合成与之互补的核苷酸序列（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）,用末端转移酶将荧光素Ｎ６ｄｄＡＴＰ标记该片段,制成庚肝病毒基因探针。在严格控制温度的条件下,与固定于硝酸纤维膜（ＮＣ膜）上血清斑点杂交,洗膜后与抗荧光素碱性磷酸酶（ＡＰ）结合,加底物后化学发光自显影判断结果。该方法检测与套式逆转录聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＲＴＰＣＲ）检测结果的阳性符合率为８８．２％,阴性符合率为１００％;并且与其他相关病毒基因无交叉反应,具有较好的特异性与灵敏性。其检测结果比ＥＩＡ法检测庚肝病毒抗体更具临床意义。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

PCR检测伪狂犬病病毒DNA

 根据伪狂犬病病毒 (PRV)gB基因的序列 ,设计并合成了一对引物 ,以闽A株细胞培养毒为模板 ,筛选最佳反应条件 ,建立了检测PRV的PCR方法 应用该方法对Fb、Bartha、BJ、GD、V2F4、S、S3、SR、Buk、Shope、Norden、MinkⅢ、HB、F8、F9、F12等毒株的细胞培养液进行基因扩增 ,均获得了分子量为 2 81bp的特异性目的DNA片段 ,而对Vero细胞与FMDV、SVDV、HCV、PRRSV、JEV、PPV等病毒进行检测 ,结果均为阴性 ,没有出现交叉反应 对PRV毒株扩增的产物测序 ,结果序列与文献报道一致 ,证明PCR扩增产物和方法的特异性 对 1994～ 2 0 0 0年期间送检的临床样品和保存的PRV毒种 ,用病毒分离、双抗体夹心ELISA和PCR等 3种方法进行检测 ,结果前 2种方法检测为阳性的 ,PCR检测均为阳性 ;PCR检测为阴性 ,前 2种方法检测也为阴性 ;可是 ,前 2种方法检测为阴性的 ,PCR却检测出部分阳性 ;经x2 检验 ,证明PCR检出率明显高于前 2种方法的检出率 对PRV闽A株细胞毒提取物DNA进行检测 ,其最低检出量为 15 8pg 对 1999～ 2 0 0 0年期间广东、福建、海南等省的 31个大中型猪场送检的 191份病料进行检测 .结果病料阳性率为 2 6 2 % ( 50 191) ,猪场阳性率为 71% ( 2 2 31) 实验结果表明 ,所建立的PCR技术可用于伪狂犬病的快速诊断