白兰瓜子叶衰老过程中蔗糖酶同工酶的分离及其活性变化

利用DEAE—纤维素柱层析对白兰瓜子叶蔗糖酶同工酶进行了分离。发现细胞质可溶性部分含有4种蔗糖酶同工酶,其中3种为酸性蔗糖酶(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),其活性最适pH分别为5.40、4.30和4.73;另外一种为碱性蔗糖酶,其最适pH为7.40。细胞壁盐溶性部分仅含1种酸性蔗糖酶,其最适pH亦为4.73。在白兰瓜子叶生长后期(7～11d),定位于细胞质的酸性蔗糖酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的活性略有升高;衰老发生后(17～23d)其活性显著下降;衰老后期碱性蔗糖酶活性消失。在子叶生长和衰老期间细胞壁酸性蔗糖酶活性则一直下降。     

日本根霉IFO5318胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及部分特性

采用硫酸铵沉淀及柱层析等步骤纯化了日本根霉IFO5318的β—葡萄糖苷酶,回收率为22％。该酶分子量约为4.0×10~5,由四个相同大小的亚基组成;最适反应温度55℃,最适反应pH5.5;对热较敏感,但能在较大的pH范围内保持稳定。用对硝基苯基—β-D-吡喃葡糖苷为底物,测得的K_m和V_(max)值分别为0.825mg·ml~(-1)和135.4μmol·min~(-1)·mg~(-1)。该酶对纤维二糖的水解能力最强,SDS、Fe³⁺、Hg²⁺等对酶活力有抑制作用。     

菜心和水稻绿叶中不同等电点的乙醇酸氧化酶

The proteins with glycolate oxidase activity from B.parachinensis Bailey and rice( Oryza sativa )green leaves were prepared respectively.From the second protein peak on DEAE\|Cellulose column,two glycolate oxidases,expressed as B.parachinensis Bailey GO Ⅲ(specific activity natove 13 2 U·mg -1 ·min -1 )and rice GOⅢ(specific activity 8 8 U·mg -1 ·min -1 ),could not migrate anywhere in 4%～20% native\|PAGE under a pH8.3 buffer system.GOⅢ's p I was about pH8.3. The protein containing B.parachinensis Bailey GOⅢ showed 67±2,43±2,and 38±2 kD in SDS PAGE,band 43±2 kD was the subunit of B.parachinensis Bailey GOⅢ.From the two proteins above,another group of glycolate oxidases,expressed as B.parachinensis Beiley GOⅠ(specific activity 5 U·mg -1 ·min -1 )and rice GOⅠ(specific activity 1 2 U·mg -1 ·min -1 ),showed only one 43±2 kD band in SDS\|PAGE,and was purified on the Sepharose\|6B column which migrated towards anode in the same native\|PAGE showing the M r about 420 kD,or 460 kD and 260 kD respectively.GOⅠ's p I was smaller than pH8.3.Antibody against B.parachinensis Bailey GOⅠ was prepared and its efficacy was about 1/1600 in ELISA.By native\|PAGE,Western blot and rocket immunoelectrophoresis,the third group of glycolate oxidases,expressed as B.parachinensis Bailey GOⅡ and rice G0Ⅱ,were confirmed in crude protein of green leaves and migrated towards cathode under the same native\|PAGE,so GOⅡ's p I was higher than pH8.3.The M r of B.parachinensis Bailey GOⅡ was about 669 kD determined by native\|PAGE Western blot.Rice GOⅠ,rice GOⅢ and rice GOⅡ showed different quantitation under different physiological conditions.Rice GOⅡ could be induced by glycolate.     

土壤杆菌固氮生理特性研究

对根癌土壤杆菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性研究结果表明,该菌具有自生固氮活性,其固氮活性的最适pH为8.0,温度为30℃.固氮活性在对数生长后期(14h)最高,延缓期和静止期乙炔还原活性较低.该菌株好氧,通过氧呼吸和吸氢酶的作用达到避氧固氮.当通入氧气超过呼吸耗氧时,对固氮活性产生抑制作用.在培养过程中增加NH_4~+浓度,固氮活性会降低,当达到15mmol/L时完全丧失固氮活性,表现NH_4~+阻遏固氮酶蛋白合成.在乙炔还原测定系统中加入NH_4~+并不影响乙炔还原反应,说明没有NH_4~+关闭现象.培养过程中加入MSX(2.5mg/ml)能解除10mmol/L NH_4~+对固氮酶合成的阻遏作用.固定的游离氮不能以NH_4~+形式分泌于胞外.固氮过程中放出大量氢气,培养16小时产氢量达65μmol H_2/mg蛋白.在限碳条件下(0.2%蔗糖)其吸氢酶活力可达520nmol H_2·ml~(-1)·h~(-1).     

日本根霉IFO5318胞外β—葡萄糖苷酶的纯化及部分特性

采用硫酸铵沉淀及柱层析等步骤纯化了日本根霉IFO5318的β—葡萄糖苷酶,回收率为22％。该酶分子量约为4.0×10~5,由四个相同大小的亚基组成;最适反应温度55℃,最适反应pH5.5;对热较敏感,但能在较大的pH范围内保持稳定。用对硝基苯基—β-D-吡喃葡糖苷为底物,测得的K_m和V_(max)值分别为0.825mg·ml~(-1)和135.4μmol·min~(-1)·mg~(-1)。该酶对纤维二糖的水解能力最强,SDS、Fe~(3 )、Hg~2 )等对酶活力有抑制作用。     

铜对三叶草-土壤酶系统的影响

通过盆栽实验研究了重金属Cu污染对植物(三叶草)-土壤酶(脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶)系统的影响.结果表明,随着Cu浓度增加,脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性均逐渐减小,与Cu浓度有高度相关性,蔗糖酶>多酚氧化酶>脲酶>过氧化氢酶.在处理浓度不变情况下,酶活性随时间而变化,且呈现低Cu浓度(<00 mg·kg^-1)时4种酶活性均有所上升,而Cu浓度增高(00～3 000 mg·kg^-1)时各酶活性逐渐下降的趋势.统计分析表明,在每一梯度浓度上,4种酶在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组内均存在显著差异性(P<0.01),与植物受重金属Cu污染时的生长情况一致.随着Cu浓度增加,土壤pH值逐渐下降,而电导率上升;同一Cu浓度下的pH值和电导率均随时间呈缓慢上升趋势,统计分析显示,二者在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组内均存在显著差异性(P<0.01).土壤pH值和电导率与4种土壤酶活性有高度相关性,多酚氧化酶>蔗糖酶>过氧化氢酶>脲酶.这4种酶同时可作为检测土壤环境质量的指标.     

菠菜叶片中乙醇酸氧化酶3种同工酶的生化特性

By DEAE cellulose and Sepharose 6B chromatography, the proteins containing glycolate oxidase isozymes GOⅡ and GOⅢ were extracted from spinach green leaves. The protein containing GOⅡ showed two bands of 67±2 kD and 40±2 kD in SDS PAGE whose specific activity of glycolate oxidase was 33.4 U·mg -1 ·min -1 .It migrated towards cathode in Native PAGE in pH 8.3 buffer system. pI of GOⅡwas about 9.4 detected by IEF. The protein containing GOⅢ showed three bands of 67±2 kD, 40±2 kD and 38±2 kD in SDS PAGE whose specific activity of glycolate oxidase 14.4 U·mg -1 ·min -1 and could not migrate anywhere in the same Native PAGE. pI of GOⅢ was about 8.3 detected by IEF. The 40±2 kD might be the subunits of GOⅡ and GOⅢ. Antibodies of the protein containing GOⅡ and GOⅢ were prepared respectively. GOⅡ was very unstable and could change into GOⅢ artifact; GOⅢ was also unstable and could change into GOⅠartifact whose Mr ≈470 kD and pI ≈7.4 . This GOⅠ(specific activity: 9.8 U·mg -1 ·min -1 ), showing one 40±2 kD band in SDS PAGE, could be purified on another Sepharose 6B chromatography. The specific activity of GOⅡ decreased rapidly to about half of its original value and then was relatively stable when stored in 50% glycerol at -20℃. The results above explained why GOⅡ was extracted difficultly, and GOⅢ were easily confused with GOⅠ and GOⅡ.     

嗜碱芽孢杆菌N16—5 β-甘露聚糖酶的纯化与性质

嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.)NI 6—5产生的三种咆外碱性β-甘露聚糖酶(β-mannana-se)经硫酸铵沉淀、两次DEAE—Sephadex A-25离子交换住层析、羟基磷灰石吸附柱层析及制备PAGE等步骤,得到了凝胶电泳均一的样品。用SDS—PAGE测得纯化的β-甘露聚糖酶M-1、M-2和M-3的分子量分别为51000、38000阳34 700道尔顿。用PAGEIEF测得等电点p1分别为4.3、2.5和2.5。酶反应的最适pH为9．0(M-1)和10.0(M-2和M-3);三种酶的最适温度均为70℃;稳定pH为10．0左右(M-1和M-2)、8.0—10．0(M-3);M-1M-2和M-3的稳定温度分别为40、55和50℃。金属离子Ag+、Hg2+和Mn2+对三种酶均有抑制作用。Β-甘露聚糖酶M-1、M-2和M-3对魔芋葡萄甘露聚糖作用的K。分别为2.9、1.7和12.5mg／ml,Vmax值分别为2 7500、47500和15700mol.min-1·mg-1。Β-甘露聚糖酶M—1水解魔芋葡萄甘露聚糖产生单糖、双糖、三糖和四糖等低聚糖。     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3+)(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~+(300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~+和 Hg(2+)”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).     

嗜热栖热菌HB 8耐热α-葡萄糖苷酶的提纯和性质

嗜热栖热菌HB 8(Thermus thermophilus<.I> H8 8 )的耐热α-葡萄糖苷酶(α-glucosidaseEC．.2.1.20)经硫酸铵分步沉淀、DEAE-纤维素柱层析和垂直板制备凝胶电泳提纯,经盘状凝胶电泳鉴定为单一区带,比活提高17倍。酶作用最适温度80℃,最适pH5．8,分子量67000,等电点Pl为4.5。该酶能够水解对硝基酚α--D-葡萄糖苷(PNPG)、蔗糖和麦芽糖,但不水解纤维二糖、蜜二糖、可溶性淀粉。酶作用于PNPG的米氏常数(Km)为0.4mmol／L,最大反应速度Vmax为0.29umol·nmin-1·mg-1。金属离子Mg2+、Mn2+、Ca2+和Ba2+对酶有激活怍用,Hg2+和Cu2+有强烈抑制作用。酶表现出极好的热稳定性,在90℃保温10小时后,仍保留90％的原始酶活力,在95℃的失活半寿期(t1/2)为108分钟．经蛋白质侧链化学修饰研究表明,羧基和组氨酸残基为其表现话力所必需。     

湖羊瘤胃微生物GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25的表达与功能表征

【目的】葡聚糖酶是饲用添加剂的重要成分,本研究旨在从湖羊消化道微生物中挖掘性质优良的GH9家族葡聚糖酶基因,用于研发新型饲用酶制剂。【方法】从湖羊瘤胃微生物cDNA中扩增IDSGLUC9-25基因,在大肠杆菌中进行异源表达,对重组蛋白进行诱导表达和纯化,研究重组蛋白的酶学性质和底物水解模式。【结果】IDSGLUC9-25基因编码527个氨基酸,包含一个CelD_N结构和一个GH9家族催化结构域;重组蛋白rIDSGLUC9-25分子量约为62.7 kDa,最适反应温度和pH分别为40℃和6.0,在30-50℃下活性较高,在pH 4.0-8.0范围内能够保持较高的稳定性,经pH 4.0-8.0缓冲液处理1 h后残余活性均大于90%;底物谱分析表明,rIDSGLUC9-25能催化大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、魔芋胶和木葡聚糖,比活性分别为(443.55±24.48)、(65.56±5.98)、(122.37±2.85)和(159.16±7.73) U/mg;利用薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析水解产物发现,rIDSGLUC9-25降解大麦葡聚糖主要生成纤维三糖(占总还原糖64.19%±1.19%)和纤维四糖(占总还原糖26.24%±0.12%),催化地衣多糖主要生成纤维三糖(占总还原糖78.46%±0.89%)。【结论】本研究报道了一种来自密螺旋体属细菌的内切β-1,4-葡聚糖酶IDSGLUC9-25 (EC 3.2.1.4),能高效催化多糖底物生成纤维三糖和纤维四糖,为研发饲用酶制剂和制备低聚寡糖建立基础。     

枯草芽孢杆菌SA-22 β-甘露聚糖酶的纯化及其特性

利用硫酸铵沉淀、羟基磷灰石柱层析、Sephadex G-75凝胶过滤和DEAE-52离子交换柱层析的方法,将枯草芽孢杆菌SA-22 β-甘露聚糖酶纯化了30.75倍,同时,该酶比活达到3478056 u/mg,收率达到23.43%。利用SDS-PAGE凝胶电泳和Sephadex G-75凝胶过滤的方法测得枯草芽孢杆菌SA-22 β-甘露聚糖酶的分子量分别为38 kD和34 kD。实验发现该酶的最适pH为6.5,在pH 5～10的范围内稳定;该酶最适温度为70℃,在50℃保温4h后其活力不变,在60℃保温4 h后剩余酶活为74.2%,70℃的酶活半衰期为3h。实验还发现Hg²⁺对酶活力有明显抑制作用。该酶对槐豆胶和魔芋胶的K_m和V_max值分别为11.30mg/mL, 4.76mg/mL和188.68(μmol·mL^-1·min^-1), 114.94(μmol·mL^-1·min^-1)。     

黑曲霉A3木聚糖酶酶学性质研究

黑曲霉A3(AspergillusnigerA3)的固体培养物浸出液,经过多步分离纯化后,获得三个组份的木聚糖酶,称为xⅠ、xⅡ和xⅢ.经7%凝胶浓度的盘状电泳分析均为单一组份.经等电聚焦电泳测xⅠ、xⅡ和xⅢ的等电点分别为6.8、5.5和6.1.SDS-PAGE测得亚基分子量(Da)分别为xⅠ,42000;xⅡ,20000;xⅢ,31000.三个酶组份的最适反应温度分别为xⅠ,40℃;xⅡ,50℃;xⅢ,50℃.最适反应pHxⅠ,3.5;xⅡ,4.5;xⅢ,5.0.保温一个小时后,酶的半失活温度分别为xⅠ,55.6℃;xⅡ,54.8℃;xⅢ,46.6℃.金属离子Ag+、Hg2+、Ni2+和脲对不同的酶组份具有一定的影响.     

产碱菌麦芽四糖淀粉酶的纯化及性质

产碱菌(Alcaligenes sp．)537．1除去菌体的培养液经硫酸铵沉淀及DEAE-纤维素离子交换柱层析,得到了凝胶电泳均一的麦芽四糖淀粉酶。纯化了141倍,酶活力回收40.1％,比活力达3308U／mg。用浓度梯度PAGE和SDS—PAGE测定酶分子量分别为68000和66000,不具亚基。用PAG-1EF测定等电点为4．45。酶反应最适pH和温度分别为7.0和60C。在pH7—10范围内稳定,该酶半衰期为37C 12小时,50 C 1小时和62 C 6分钟。 麦芽四糖淀粉酶是糖蛋白,含有4％左右的糖,含有27．10％酸性氨基酸、11.08％碱性氨基酸和1．82％色氨酸。     

大弹涂鱼和中华乌塘鳢肠刷状缘膜消化酶活性的比较

采用酶学分析的方法,研究了大弹涂鱼和中华乌塘鳢肠刷状缘膜的麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖酶、纤维二糖酶、碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶等8种消化酶的活性。结果表明:1)大弹涂鱼肠Ⅱ刷状缘膜的麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖酶和纤维二糖酶等5种二糖酶的比活力均显著高于肠Ⅰ和肠Ⅲ(P<0·05);中华乌塘鳢肠Ⅰ刷状缘膜除乳糖酶外,其余4种二糖酶的比活力均显著高于肠Ⅱ和肠Ⅲ(P<0·05);大弹涂鱼肠Ⅲ碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶等3种消化酶的比活力均显著高于肠Ⅰ和肠Ⅱ(P<0·05);中华乌塘鳢肠Ⅱ的这3种消化酶的比活力均显著高于肠Ⅰ和肠Ⅲ(P<0·05);2)大弹涂鱼各段肠刷状缘膜的5种二糖酶的比活力均显著高于中华乌塘鳢(P<0·05),前者肠刷状缘膜碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶等3种消化酶的比活力整体上也稍微高于后者。由此说明:8种消化酶的活性在大弹涂鱼和中华乌塘鳢肠刷状缘膜中的分布模式明显不同,大弹涂鱼和中华乌塘鳢对二糖的消化和吸收的主要部位分别是在肠Ⅱ和肠Ⅰ,而二者对蛋白质、脂类和无机盐等营养吸收的主要部位分别是在肠Ⅲ和肠Ⅱ;大弹涂鱼和中华乌塘鳢肠刷状缘膜的5种二糖酶的活性与两者的食性关系密切,而碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶等3种消化酶的活性与两者的食性并无密切的相关性。     

黑曲霉菊糖酶的纯化及性质

黑曲霉(Aspergillus niger)319发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素52离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析,得到了电泳纯的菊糖酶组分。提纯倍数为67,收率为25.5％。菊糖酶的最适pH为5.0,最适温度为60℃。此酶为单亚基蛋白,凝胶过滤法测得分子量为28000,含糖13.9％,用等电聚焦法测得等电点为5.4,该酶对温度有较高的稳定性,对pH的稳定范围较窄。Hg²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺对该酶有强烈的抑制作用。此酶对菊糖有较强的底物专一性,产物为果糖,但它也可作用于蔗糖,I/S值为0.348。当以菊糖为底物时,K_m为6.25mmol/L,V_m为67.11 μmol·mg~(-1)·min~(-1)。     

里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting凝胶色谱脱盐、Source 15 Q阴离子交换色谱技术,里氏木霉(Rut C-30)纤维素酶主要组分得以初步分开,再经过Source 15 S阳离子交换色谱、HiPrep Sephacryl S-100 HR凝胶过滤色谱、Superdex 75 PrepGrade凝胶过滤色谱进一步分离纯化,得到2个纯化的内切葡聚糖酶组分EGⅡ、EGⅠ和一个外切葡聚糖酶组分CBHⅠ;经过SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯,测得相对分子质量分别为5.22×104,5.62×104和6.90×104。EGⅡ的最适反应pH是5.6,最适反应温度为65℃;EGⅠ的最适反应pH是4.4,最适反应温度为55℃;以羧甲基纤维素(CMC)为底物时,EGⅠ、EGⅡ的米氏常数(Km)分别为2.20 mg/mL、3.38 mg/mL。CBHⅠ的最适反应pH是5.8,最适反应温度为60℃,以对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(PNPC)为底物时,米氏常数(Km)为0.12 mg/mL。     

脱墨用棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中内切酶的纯化及性质

通过Bio-Gel P-60分子筛和DEAE-与Q-sepharose离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中五种内切酶组分EGⅡ-1、EGⅡ-2、EGⅢ-1、EGⅢ-2和EGⅣ,并且对这五种内切酶组分的基本性质进行了研究.通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量分别为38.7,34.4,31.4,36.9和23.7kD,等电点分别为pH＜3.5,＜3.5,4.9,4.5和5.0.5个酶组分均属酸性纤维素酶,最适pH在3.5～4.0之间;最适温度分别为55℃、60℃、(60～70)℃、(60～70)℃和60℃.各酶组分有较宽的pH稳定性;温度稳定性表现为EGⅡ-1＞EGⅡ-2＞EGⅢ-1＞EGⅢ-2＞EGⅣ.EGⅡ-1和EGⅡ-2有较高的底物专一性,而EGⅢ-1、EGⅢ-2和EGⅣ对木聚糖有交叉活性.Fe2+对除EGⅣ以外的四种酶组分都有激活作用,尤其是对EGⅢ-2有强烈的激活作用.动力学分析表明各纤维素酶组分对底物亲和力的大小与酶的催化率之间并无相关性.     

黑曲霉纤维素酶系中β-葡聚糖纤维二糖水解酶的提纯和性质

通过硫酸铵分段,Sephadex G-100凝胶过滤及DEAE-SephadexA-25(A-50)离子交换柱层析等提纯步骤,从黑曲霉(Aspergillus niger)培养液中分离到β-葡聚糖纤维二糖水解酶的两个组分(Ⅰ-3a,Ⅰ-3b),经凝胶电泳鉴定均为单一带,Ⅰ-3a和Ⅰ-3b的最适pH分别为4.0及4.5,最适温度50℃及45℃,在pH2.0—8.0之间稳定,保温1h时的半失活温度t 1/2分别为52℃及48℃。SDS-凝胶电泳法测得Ⅰ-3a和Ⅰ-3b的分子量分别为57000及55000;聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦法测得二者的等电点分别为3.2和3.0。在所测定的化学试剂中,Ag~+、Hg~(2+)和Cu~(2+)对该酶均有较强的抑制作用。     

固定化青霉素G酰化酶水解头孢菌素G制备7—ADCA的研究

用聚丙烯腈纤维固定化青霉素酰化酶水解头孢菌素G制备7-ADCA,固定化酶对头孢菌素G的最适pH为9.0,最适温度50℃。在37℃、pH8.0固定化酶对头孢菌素G的表观米氏常数为1.67×10~(-2)mol/L。最大反应速度为3.01mmol·g~(-1)·min~(-1)。头孢菌素G溶液浓度在2％以上时,对固定化酶有明显的抑制作用。固定化酶水解头孢菌素G的最佳投料浓度为5％～6％,水解时用酶量以每克头孢菌素G投300U以上为好。按上述条件水解头孢菌素G,操作25批后固定化酶保留活力77.8％,7-ADCA平均收率92.68％。