利用环境胁迫提高破囊壶菌二十二碳六烯酸生产的研究进展

破囊壶菌由于具备生产多种高值天然活性物质的能力，如二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)、角鲨烯和类胡萝卜素等，目前已被视为商业脂质生产的优质来源。本文首先对破囊壶菌的生态作用和生物技术价值进行介绍，并概述了脂肪酸的两条生物合成途径；其次重点阐述了NaCl、温度、溶氧和pH这4种环境胁迫因子对破囊壶菌生长、脂质积累、脂肪酸组成和DHA生产的影响；随后总结了当前利用环境胁迫因子的渗透调节策略、分段发酵策略和缓解氧化应激策略提升破囊壶菌DHA生物合成能力的研究现状；最后指出了破囊壶菌在环境胁迫的分子调控机制、分段式发酵策略、菌株进化及代谢工程等方面存在的问题，并对如何改进这些问题以及未来可能的发展方向进行了展望。该综述旨在为破囊壶菌实现高效工业化生产DHA提供有效的参考。     

用基因工程方法研制廿二碳六烯酸

廿二碳六烯酸(DHA)能促进脑细胞的生长发育,改善大脑机能和行为学习,防治中枢神经疾病,是人及其它动物重要的必需多不饱和脂肪酸。目前,DHA主要来自深海鱼油的分离制备。利用微生物发酵生产DHA仍处于实验室阶段。破囊壶菌(Thraustochytriumroseum)是合成DHA的优良海洋真菌。研究与筛选破囊壶菌DHA合成突变株,克隆破囊壶菌DHA合成关键酶基因,进而在酵母真核表达系统中表达,可为今后对该酶进行更深入的研究及应用建立良好的基础。用基因工程方法研制重组DHA,将开拓广阔的应用前景。     

破囊壶菌利用工农业废弃物生产脂肪酸的研究进展

破囊壶菌因具有高产脂肪酸的特性而受到广泛关注,然而传统的培养方式需要的原料成本很高,很大程度上阻碍了破囊壶菌的工业化进程,因此,寻找可被破囊壶菌高效利用、来源广泛并且廉价易得的生产原料成为该领域的研究重点。本文以破囊壶菌及其生产脂肪酸为切入点,综述了近年来破囊壶菌利用工农业废弃物生产脂肪酸的研究现状,总结并提出了其发展前景,以期对今后的研究有所启发。     

深圳海域6株破囊壶菌的生长特性及油脂成分分析

【目的】从深圳海域分离得到6株破囊壶菌,对其基本形态特征、生活史和油脂含量等进行研究,开发其应用潜力。【方法】使用松花粉垂钓法对破囊壶菌进行分离,通过18S r RNA基因测序的方法对破囊壶菌进行鉴定,用显微镜观察其基本形态特征,通过使用尼罗红(Nile Red)染色法对油脂含量进行定性检测,并用GC-MS分析菌株的油脂含量和组成情况。【结果】18S r RNA基因鉴定其属于Aurantiochytrium sp.、Schizochytrium sp.和Thraustochytrium sp.三个属。破囊壶菌的脂肪酸主要成分为十六碳饱和脂肪酸和二十二碳六烯酸(DHA),其中Mn11和Mn15的饱和脂肪酸含量达到总脂肪酸含量的70%以上,Mn16和Sw7的DHA产量分别达到1.29 g/L和1.26 g/L。【结论】Mn11和Mn15菌株适合用于生物柴油的生产,Mn16和Sw7是DHA发酵生产的潜力菌株。     

一株具有工业化生产DHA前景的破囊壶菌

多不饱和脂肪酸是保持人体健康不可缺少的营养成分之一,尤其是二十二碳六烯酸(DHA)作为细胞膜磷脂的重要组分,具有非常重要的医药应用和营养价值。目前,在食品工业中,DHA已经添加至牛奶或奶粉中,用作功能性营养强化剂。20世纪80年代,DHA的唯一来源是鱼油,但鱼油的腥味、重金属污染等问题,促使人们探索生产DHA的其他途径如微生物发酵。诱变和筛选是微生物选育过程中比较重要的手段,可以快速使菌株朝着人类所需要的方向突变。UV诱变和化学药物胁迫筛选是使野生株定向突变的一种很好的办法。目前国内外研究主要针对裂殖壶菌属菌株进行诱变育种,许永利[1]用紫外线诱变和喹禾灵筛选方法对裂殖壶菌(Schizochytrium limacinu)进行诱变选育,突变菌株生物量和DHA含量比对照菌株均有提高。吴克刚等[2]利用添加植物激素对Thraustochytriu roseum MF2进行培育诱变,从而获得更高的DHA量,但在脂质含量和DHA在脂质占比率上都不存在明显变化。本期介绍梁园梅、成家杨等[3]发表的论文《高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变株的筛选》,作者采用紫外线和药物双重诱变胁迫破囊壶菌获得一株突变株,其在生物量、脂质含量和DHA在脂质占比率上都有显著性提高,相比前人的研究,作者获得的突变株有显著优越性,且突变株DHA生产能力传代4次后仍然保持稳定,具有较高的工业价值。在后续的研究中作者若能对筛选条件、培养基(如利用廉价碳源)和培养条件等方面实行进一步优化,提高突变株生物量,降低突变株发酵生产DHA生产成本,将能获得更高的商业价值。     

植物激素对破囊壶菌生长与产DHA的影响

研究了植物激素对破囊壶菌(Thraustochytrium roseum) MF2产DHA的影响作用。实验结果表明：植物激素对T.roseum MF2的生长和产DHA有很大影响;赤霉素(GA)能促进DHA的合成,6苄基腺嘌呤(BA)能显著促进T.roseum　MF2的生长,二者的配合使用能明显增加DHA的产量;培养基中适宜的添加量为2mg/L GA和3mg/L BA,可使DHA产量达到982mg/L。     

壶菌感染对两栖动物种群影响的研究现状与挑战

加强生物多样性保护与共建地球生命共同体是我国的重大战略。两栖动物是脊椎动物中生物多样性受威胁最严重的类群,两种壶菌Batrachochytrium dendrobatidis (Bd)和B. salamandrivorans (Bsal)的感染是两栖动物多样性下降的主要因素之一。Bd主要感染两栖动物无尾目、有尾目和蚓螈目的皮肤,可能引起两栖动物淋巴细胞凋亡和全身电解质失衡。Bsal主要感染有尾目,可能导致两栖动物致命的败血症。针对壶菌及其感染对两栖动物种群影响的研究在国外已经开展了大量工作,然而我国在该领域的研究有限。本文通过检索1990–2022年国内外文献,梳理和总结了壶菌病原的可能起源与传播、壶菌感染的发病机制、壶菌毒力的影响因素和壶菌病原体的诊断与防治等领域的研究,并提出了未来的研究方向和技术方法的改进需求,如利用全基因组测序技术溯源、开发RPA技术进行野外检测和应用转录组学研究宿主–病原体的免疫等。最后,提出以下4条建议:(1)建设壶菌病原基础数据平台,建立壶菌病常规检测部门,并将壶菌病监测纳入野生动物疫病监测体系;(2)深入开展我国两栖动物不同地理区系壶菌感染情况的相关研究...     

壶菌病与两栖动物的种群衰退

两栖类种群全球性衰退是21世纪最紧迫的环境问题之一。越来越多的证据表明壶菌(Batrachochytrium dendrobatidis)与澳大利亚、美洲北部、中部、南部及欧洲的两栖类种群衰退有关。由壶菌引起的壶菌病是变态后的无尾类所患的一种显性传染病,其令人质疑的快速传播及广泛爆发对世界范围内的两栖类种群构成重大威胁。本文对这种致病壶菌的病理学、生态学、生物地理学及其治疗方面的进展进行了综述。     

基于同源重组的裂殖壶菌遗传转化体系的构建及验证

【目的】裂殖壶菌是一种能高效生产DHA的海洋真菌;基因工程技术已经成功应用在微生物改造和代谢机理研究中,利用基因工程技术对裂殖壶菌进行改造首先需要构建适合裂殖壶菌的遗传转化体系;【方法】本文利用电转化的方法将含有18S r DNA同源重组片段的ble基因导入裂殖壶菌中,通过zeocin抗性平板筛选出阳性菌株,并设计ble基因引物,以裂殖壶菌基因组为模板,进行PCR验证ble基因是否成功结合到裂殖壶菌染色体上。【结果】筛选获得的抗性菌株基因组上确实PCR出ble基因片段,对改造菌株与原始菌株进行发酵培养,发现改造后菌株在生物量、油脂含量、DHA含量及脂肪酸分布等方面和原始菌株基本一致。【结论】抗性基因的插入不会影响菌株的正常代谢,该体系的构建为后续其他外源基因导入奠定基础。     

真菌Batrachochytrium dendrobaidis是蛙类种群衰退的近因吗?

蛙类衰退是过去二十年来全球许多地区倍受关注的问题, 澳大利亚似乎是衰退的热点地区。当前研究所形成的主流假设是, 真菌Batachochytrium dendrobatidis 引发的壶菌病导致蛙类种群衰退。我们在毗邻农业和城市发展区的天然未开垦林地内, 用陷阱捕捉三个与大面积临时湿地相连生境中的蛙类。作为这项庞大研究工作的一部分, 我们观察了壶菌流行病, 确认了这类真菌的感染率。在各年份中, 该地蛙类中仅斑点草蛙(Limnodynastes tasmaniensis) 有些个体因此类病症死亡, 尽管该种的若干近缘种亦是该地蛙类的一部分; 病疫流行的证据仅见于其中一个年份。在所有具有典型壶菌病症状死亡的动物中, 仅22%的动物表皮受真菌感染。虽然种群中存在壶菌病, 我们认为这不是影响种群内个体死亡率的近因。根据这一观察, 我们质疑B. dendro batidis 是蛙类死亡主要原因假设的正确性。     

真菌Batrachochytrium denrobaidis是蛙类种群衰退的近因吗？

蛙类衰退是过去二十年来全球许多地区倍受关注的问题,澳大利亚似乎是衰退的热点地区。当前研究所形成的主流假设是,真菌Batrachochytrium denrobaidis引发的壶菌病导致蛙类种群衰退。我们在毗邻农业和城市发展区的天然未开垦林地内,用陷阱捕捉三个与大面积临时湿地相连生境中的蛙类。作为这项庞大研究工作的一部分,我们观察了壶菌流行病,确认了这类真菌的感染率。在各年份中,该地蛙类中仅斑点草蛙(Limnodynastes tasmaniensis)有些个体因此类病症死亡,尽管该种的若干近缘种亦是该地蛙类的一部分;病疫流行的证据仅见于其中一个年份。在所有具有典型壶菌病症状死亡的动物中,仅22％的动物表皮受真菌感染。虽然种群中存在壶菌病,我们认为这不是影响种群内个体死亡率的近因。根据这一观察,我们质疑B.dendrobatidis是蛙类死亡主要原因假设的正确性。     

水环境中的几种物质对大链壶菌灭蚊效率影响的初步研究

1991年1—4月,作者在实验室中观察了水中分别加入肝粉、葵花籽粉、田泥、淤泥、丝藻和人造沙后,对致倦库蚊幼虫的大链壶菌(Lagenidium giganteum)感染率的影响。发现除人造沙外,其他几种物质皆能明显地增加蚊虫的大链壶菌感染率。并且在一定范围内,蚊虫感染率与所加物质的量成正相关关系。据估计,每100ml水中加入6.4mg葵花籽粉或6mg肝粉分别可使蚊虫感染率增加2倍和3倍。作者认为大链壶菌在肝粉和葵花籽粉中弥漫地腐生生长,并释放大量额外的游动孢子,是这两种有机物增加蚊虫感染率的主要原因。 对田泥、淤泥和人造沙的研究表明,土壤肥力与蚊虫感染率的增加有关。丝藻则可能是由于净化水质造成有利于大链壶菌游动孢子活动的环境而增加蚊虫的感染率。     

气候变化和青蛙之死

当J．Alan Pounds等人报告哥斯达黎加蒙特维多云雾森林中的金蟾蜍和多色蟾蜍（斑蟾）出现了消失,科学家逐渐意识到上个世纪80年代各种青蛙物种消失的事情,直道20世8E90年代末期,研究人员才发现令全球青蛙神秘消失的可疑元凶：一种传染性疾病,壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）引起的壶菌病。     

哲罗鱼消化系统器官发生发育的组织学观察

采用形态观察与连续组织切片技术,对哲罗鱼(Hucho taimen)胚胎期(水温7~8℃)和胚后期(水温3~14℃)消化系统的发生发育进行观察和研究。结果表明,哲罗鱼受精11d形成原始的消化管。受精18d肝原基出现,U型胃雏型形成。受精30d鱼体破膜,口能自由闭合。破膜8d后,齿形成,肛门与外界相通,消化道初步形成口咽腔、食道、U型胃、肠和肛门。破膜16d,胰及瓣囊出现,仔鱼消化系统初步具备了摄食和消化外源性食物的能力。破膜24d后,鱼体开始上浮,主动摄食,由内源性营养转向混合性营养。破膜30d后,卵黄囊完全被吸收,各消化器官功能和结构逐步发育完善,鱼体由混合性营养进入外源性营养阶段。此后随着鱼体的生长消化器官逐步发育成熟,舌齿和下颌齿分别为双排,胃腺发达,形成网状结构,幽门盲囊较多,肠为直行,肝和胰为相互分开的独立器官。     

虫生串胞壶菌——线虫内寄生真菌

本文报道在我国粒线虫(Anguina sp．)上首次发现的虫生串胞壶菌(Myzocytium vermieolum),并对该菌的形态特征及侵染线虫的方式和过程进行了观察、研究和描述。     

酶法破碎裂殖壶菌提取胞内油脂

采用酶法破碎裂殖壶菌提取胞内油脂,进行单因素实验和正交实验优化酶解反应条件,酶解反应的影响因素主次顺序依次为酶用量、温度、时间、pH,最佳酶解工艺参数:55 ℃、pH 9.5、搅拌反应2.5 h、酶用量为菌体生物量的2%.在该条件下,胞内油脂的提取量高达(81.53±0.33) g/L,过氧化值仅为0.15,酸价为0.24.     

破囊壶菌脂肪酶基因的克隆、双温控自诱导表达及酶学性质研究

【目的】克隆破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源高效表达,并进行初步酶学性质研究。【方法】基于转录组数据注释,获得脂肪酶基因lip,构建重组基因工程菌Rosetta(DE3)/p ET30-lip,利用双温控自诱导方法高效表达蛋白,表达产物(LIP)经Ni-Agarose His亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从Aurantiochytrium sp.PKU#SW7中克隆得到一个大小为873 bp的脂肪酶基因(Gen Bank登录号为KT305964),该酶对p-NPB最适反应温度和pH分别为40°C和8.0。以不同浓度的金属离子Ca~(2+)和Co~(2+)溶液分别保温处理酶液30 min可使酶活提高1.3倍左右;甲醇对脂肪酶的抑制作用不明显。在最适反应条件下对p-NPP与p-NPB的酶活力分别为70.0±3.1 U/mg和102.5±2.6 U/mg。【结论】Aurantiochytrium sp.PKU#SW7脂肪酶具有良好的特性,符合生物柴油生物催化剂基本要求。     

利用原生质体融合技术选育淀粉发酵产DHA的新型裂殖壶菌

以生产DHA的裂殖壶菌(Schizochxtrium)B4D1和黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 3.316为出发菌株,利用原生质体融合技术选育可以利用淀粉发酵生产DHA的新型裂殖壶菌。用裂解酶制得了两亲本的原生质体,通过研究两亲本培养时间、培养方法、酶解时间等条件对原生质体产量影响的基础上,以PEG介导进行了原生质体的融合,最终确定了原生质体融合最佳条件为40%的PEG6000,融合温度30℃,融合时间为10 min,在此条件下融合率可达1.9%。通过比较菌落外观、颜色、形态以及分离培养筛选获得了一株利用淀粉裂殖壶菌融合子。经过RAPD验证表明B4D1与CGMCC 3.316发生了重组,融合菌株表达了更多源于B4D1的遗传信息。     

水环境中的几种物质对大链壶菌灭蚊效率影响的初步研究

１９９１年１－４月,作者在实验室中观察了水中分别加入肝粉、葵花籽粉、田泥、淤泥、丝藻和人造沙后,对致倦库蚊幼虫的大链壶菌感染率的影响。发现除了造沙外,其他几种物质皆能明显地增加蚊虫的大链壶菌感染率。并且在一定范围内,蚊虫感染率与所加物质的量成正相关关系。据估计,每１００ｍｌ水中加６．４ｍｇ葵花籽粉或６ｍｇ肝粉分别可使蚊虫感染率增加２倍和３倍。作者认为大链壶菌在肝粉和葵花籽粉中弥漫地腐生生长,并释放     

西藏羊八井废弃热井沉积物中的真核微生物多样性

【目的】研究西藏羊八井废弃热井沉积物中的真核微生物多样性。【方法】采用ITS-rRNA基因分析法构建了沉积物中真核微生物的ITS-rRNA基因文库, 随机抽取文库中的克隆子进行扩增rDNA限制性酶切片段分析(ARDRA), 并对ITS-rRNA基因进行了系统发育分析。【结果】沉积物中主要的真核微生物有子囊菌、壶菌、担子菌、丝足虫、后生动物和非培养真菌。其中壶菌Chytridiales sp.、Physoderma maydis和Powellomyces sp., 子囊菌的假丝酵母(Candida parapsilosis)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)和短梗霉(Aureobasidium pullulans)以及后生动物的轮虫(Lecane bulla)均未有报导存在于热泉或热井中。【结论】羊八井热井沉积物中具有丰富的真核微生物多样性。