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《中国生物化学与分子生物学报》2001,17(3):339-339
按中国生物化学与分子生物学学会 2 0 0 1年活动计划 ,学会委托北京师范大学生命科学学院生物化学及分子生物学系再次举办“分子生物学实验技术培训班” ,特发通知如下 :1 培训内容主要有 :感受态细胞的制备和转化 ;质粒的提取 ;琼脂糖凝胶电泳 ;限制性内切酶酶切 ;DNA连接酶连接及重组质粒的构建 ;PCR技术 ;Southern杂交 ;蛋白质印迹 ;真核细胞DNA制备和分析 ;植物总RNA的提取 ;外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 ;DNA序列测定等 .培训的方式主要是在教师的讲解和辅导下 ,让每位学员自己动手做每一个实验 .此外还安… 相似文献
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为制备用地高辛精(Digoxigenin,Dig)标记的酶氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase,TH)RNA探针,本研究用分子生物学技术重组质粒PGEMTHI,即分别将携带T7和Sp6启动子的PGEM-3zf质粒和携带TH基因的PKSTH质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化,得到带T7和sp6启动子的DNA片段和TH基因片段;经T4DNA连接酶连接后转入大肠杆菌,得到pGEMTH1重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测,证实其确有TH基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状DNA片段,用T7RNA聚合酶转录合成带有Dig标记的高比活度的单链RNA探针;经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。 相似文献
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红树DNA的十六烷基三甲基溴化铵法提取及其随机扩增多态DNA反应 总被引:7,自引:0,他引:7
采用CTAB法提取了耐盐植物红树DNA,所得DNA样品的紫外吸收A258/A280比值为1.89,纯度能符合限制性内切酶酶切、PCR反应以及DNA重组克隆等分子生物学操作的要求.方法简便,容易掌握,较普通的酚-氯仿法有明显的优点.还探讨了以CTAB法制备的红树DNA为模板进行RAPD反应参数的优化组合 相似文献
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我们在生物化学与分子生物学实验教学中开设了质粒 DNA制备及酶切鉴定实验。鉴于本科生实验单元时间短 (4学时 ) ,用常规的 Brinboim和 Doly方法进行质粒 DNA的制备往往不能在规定学时内完成实验。因此 ,我们对原有的实验方法 ,略加改进 ,采用高离子浓度中性盐一步沉淀质粒 DNA,制备出高纯度、高产率的质粒 DNA样品。1 材料与方法1.1 材料 p UC19重组质粒为本室构建 (内插入一约为 1kb大小的片段 ) ;LB培养基 ;溶液 (含 5 0 mmol葡萄糖 ,10 mmol EDTA,2 5 mmol Tris- HCl,p H8.0 ) ;溶液 (含新鲜配制 0 .2 N Na OH及 1%… 相似文献
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用异丙醇沉淀法快速提取质粒DNA 总被引:6,自引:0,他引:6
质粒 (plasmid)是 1种染色体外的稳定遗传因子 ,大小在 1~ 2 0 0 kb之间 ,具有双链闭合环状的 DNA分子 ,主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中进行繁殖和表达 ,是分子生物学实验中常用的工具。制备质粒 DNA的方法有许多 ,但大多需要苯酚、氯仿抽提以除去蛋白 ,而饱和酚的配制及氯仿等有机溶剂的挥发性气味给以学生为主体的教学实验带来了诸多不便。我们经过实验 ,提出了一种快速提取质粒的方法 ,该方法避免了上述不便并可提取足够量的较纯的质粒 ,在限制性内切酶酶切、DNA转接中可以… 相似文献
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一种提取质粒DNA的改良方法 总被引:16,自引:1,他引:16
本文详细介绍了一种改良碱裂解法提取质粒DNA的方法,该法采用NH4Ac代替苯酚和氯份的抽提过程,得率高,质量好,完全达到了分子生物学常规实验的要求,如酶切、连接、转化大肠杆菌、PCR等,甚至用于序列测定和植物遗传转化,该法重复性好,操作简单、实用. 相似文献
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人在早期胚胎时tPA基因表达,但mRNA丰度很低。以17日龄人胚胎为材料,分离mRNA,以表达质粒pSPORT1为载体,建立cDNA文库,重组子达到1.6×106个,能包含极低表达基因的CDNA。从人血白细胞基因组中扩增出一条175bp的tPA外显子片段作探针,用地高辛标记进行菌落原位杂交,获得六个阳性菌落。提取阳性菌落质粒,经限制性内切酶Sal Ⅰ和EcoRⅠ酶切分析鉴定,得到3个tPAcDNA重组子。 相似文献
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本文介绍一种简单快速分离质粒DNA方法。此方法有两个主要步骤。用这种方法分离的质粒DNA纯度高、无RNA,并可用于酶切、连接等操作。 相似文献
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从簇毛麦叶片中提取总RNA,进一步分离mRNA。以mRNA为模板反转录合成cDNA,两端经T4DNA多聚酶修平后加EcoR1接头分子,连接于质粒pGEM-7Zf(+)的EcoR1克隆位点,转化大肠杆菌JM103菌株建立了cDNA文库。用PCR扩增重组质粒的cDNA插入序列,用^32P标记后分别与HindⅢ或XbaⅠ酶切的小麦-黑麦附加系DNA进行Southern杂交。根据其杂交结果,目前已鉴定出4 相似文献
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用脉冲电场凝胶电泳和双标记基因质粒DNA转染技术研究辐射敏感的毛细血管扩张性共济失调症患者皮肤成纤维细胞(AT5BIVA)和正常辐射抗性的人宫颈癌细胞(HeLaS3)DNA双链断裂重接修复率及其忠实性。结果表明γ射线照射诱发DNA双链断裂的产额和重接修复率,在两株细胞间无差别.而AT细胞对导入的限制性内切酶EcoRV产生双链断裂质粒DNA的重接修复忠实性显著低于HelaS3te胞,表明AT细胞易发生DNA错误修复,这很可能就是AT细胞高度辐射敏感性的主要原因。 相似文献
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本文介绍一种从重组质粒中快速提纯DNA插入片段的方法。质粒DNA的制备简单、快速、分离的质粒DNA可用于限制性酶切和转化大肠杆菌等。从琼脂糖凝胶中提纯DNA插入片段的方法操作简单,回收效率高,提纯的DNA片段可用于连接和制备杂交探针等。 相似文献
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利用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从人胚胎组织中提取总RNA,经Oligo(dT)纤维柱分离纯化出mRNA。用逆转录与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法,扩增出人类胰岛素生长因子Ⅱ的cDNA片段,在限制性内切酶SmaI存在的连接体系中,将扩增出的cDNA片段克隆进PUC12的SmaI位点处。经限制性内切酶EcoRI,SalI,Eco47Ⅲ酶切鉴定其方向。以重组质粒的双链DNA为模板,用末端终止法测 相似文献
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牛病毒性腹泻病毒基因组cDNA文库的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)┥nL株的基因组RNA为模板,经逆向转录酶作用,合成第一链cDNA,再以RNadse/H与DNA聚合酶I联合作用合成dscDNA,并以dC同聚物尾化。pUC8DNA在Pst I酶解后,以dG同聚物尾化,两者退火构成重组质粒,转化到E.coli JM101受体菌中,另以γ-^32P-ATP标记BVDV RNA制备探针,通过菌落原位杂交筛选重组子。酶切分配表明重组质粒插入 相似文献
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利用含红霉素抗生基因和缺启动子-信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒pGPB14为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子-信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体DNA经Sau3A酶解后与BanHI酶切的质粒pGPB14连接,转化大肠杆菌C600,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的DNA片段在0.27-1.5kb之间。用Sanger 相似文献
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制备CVB3结构蛋白和非结构蛋白重组质粒DNA疫苗时,采用RT-PCR从CVB感染的HeLa细胞中扩增VP1、VP2、2A和3D基因,重组入真核表达质粒pcDNA3中,构建pcDNA3/VP2、pcDNA3/VP1、pcDNA3/2A和pcDNA3/3D重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞COS-7,用RT-PCR检测mRNA的转录,用Western-blot检测表达产物。结果4种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为CVB3相应序列,Western-blot证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建CVB3结构与非结构蛋白的重组质粒DNA疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。 相似文献
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利用含红霉素抗性基因和缺启动子-信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒pGPB14为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子-信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体DNA经Sau3A酶解后与BomHI酶切的质粒pGPB14连接,转化大肠杆菌C600,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的DNA片段在0.27-1.5kb之间。用Sanger的双脱氧链终止法测定了10个克隆片段的DNA顺序,结果表明,克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β-内酰胺酶活力测定结果证明:大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。 相似文献
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限制性内切酶BamHI水解中国野生葡萄葛lei的叶绿体DNA(cpDNA),电泳分离为34条带,最大为11.7kb,最小为0.23kb,分别为pUC和pBR322质粒克隆所得片段,转化大肠杆菌,并从转化菌中提取质粒DNA,经酶切电泳分析证明含有葛lei cpDNA经BamHI水解的不同片段,从而构建了葛lei cpDNA的BamHI质粒文库。 相似文献