泛素C末端水解酶L1的生理和病理学意义

泛素C末端水解酶L1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolases L1)属于泛素C末端水解酶家族成员,但是泛素C末端水解酶L1酶活性非常特异,不仅具有泛素C末端水解酶活性,而且具有泛素C末端聚合酶的活性.因此,泛素C末端水解酶L1,不仅在泛素化蛋白降解途径中起到关键的作用,也在其他的泛素信号途径,如在K63-多聚泛素信号途径中起重要的作用.由于泛素C末端水解酶L1特异的蛋白酶活性,也赋予了泛素C末端水解酶L1多种生物学功能,在神经发育发生、精子发生、卵子发生和受精等方面有着重要的作用.泛素C末端水解酶L1突变也与帕金森症等神经元退化疾病紧密相关.泛素C末端水解酶L1在甲状腺、肺等多种组织的超表达,也与该组织的癌症发生有着密切的联系.     

泛素C末端水解酶L1对神经元的保护作用

泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)是一种在脑内高度表达,具有泛素水解酶、泛素连接酶和稳定泛素单体功能的去泛素化酶．UCH-L1参与维持神经元突触的正常形态及功能,并能够缓解β-淀粉样蛋白诱导的长时程增强(LTP)缺失及记忆障碍;此外,UCH-L1的突变体I93M与家族性帕金森氏病相关,而UCH-L1的S18Y多态性则对神经元具有保护作用．通过研究UCH-L1的结构、功能及其在神经系统的作用机制,可以为阿尔茨海默病、帕金森氏病等神经退行性疾病的治疗提供相关思路和借鉴．     

Prohibitin特异性MiRRNAi表达载体构建及其干扰效果测定

目的：构建携带prohibitin（PHB-1）基因的MiRRNAi真核表达载体pcDNA^TM 6．2-GW／EmGFP-MiR,并观察其转染HEK293细胞株前后PHB-1的表达变化。方法：根据GenBank中prohibifin的序列,设计特异的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链,克隆至pcDNA^TM6．2-GW／EmGFP-MiR质粒缺口末端,连接在质粒上生成含MiRRNAipcDNA^TM6．2．GW／EmGFP-MiR-PHB载体,测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至HEK293细胞中,用Westernblotting检测干扰后HEK293细胞内PHB-1表达的变化。结果：将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。Westernblotting检测结果证实构建的PHB-1 MiR RNA表达重组体可显著抑制HEK293细胞内PHB-1的表达。结论：成功构建了携带PHB-1基因的MiR RNAi真核表达载体。     

核转录因子TR3小干扰RNA载体的构建及其效果鉴定

目的：构建核孤儿受体TR3的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并进行沉默效果测定。方法：根据TR3 mRNA序列和载体psiSTRIKE的粘性末端,设计合成TR3的干扰RNA序列,退火后克隆至psiSTRIKE,经测序鉴定后用阳离子脂质体将重组子和TR3高表达载体TR3-pcDNA共转染至HEK293细胞中,以Western blotting检测干扰后HEK293细胞内TR3表达的变化。结果：Western blotting检测结果证实构建的TR3 siRNA表达重组载体可显著抑制HEK293细胞内TR3的高表达。结论：构建了核孤儿受体TR3 siRNA真核表达载体。     

Sp1基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建干扰载体pSilencer3.1-Sp1,并初步研究其对Sp1基因的干扰作用。方法：根据Sp1cDNA编码序列,设计并合成针对Sp1基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干扰载体中,构建Sp1基因小干扰RNA（siRNA）真核表达载体pSilencer3.1-Sp1;分别将阴性对照载体pSilencer3.1与重组载体pSilencer3.1-Sp1经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Sp1基因的转录与表达水平。结果：构建了Sp1基因siRNA真核表达载体pSilencer3.1-Sp1,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果。结论：特异性siRNA能明显抑制Sp1基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Sp1的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

Split-marker 重组技术构建泛素C 末端水解酶基因缺失菌株

目的:对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)泛素末端水解酶(creB)基因进行敲除。方法:通过氨基酸序列分析软件初步分析烟曲霉CreB蛋白结构.利用split-marker重组技术构建重组片段,并通过PEG-原生质体方法对烟曲霉野生菌株进行转化,采用PCR方法对转化子进行筛选,最后选取初步筛选的转化子进行测序鉴定。结果:结构分析显示烟曲霉CreB蛋白具有泛素特异蛋白酶(ubiquitin-processing protease)UBP亚家族六个结构域。本实验构建了转化片段并转化,在抗性平板中获得了25个Hyg抗性转化子,进一步采用PCR方法筛选到20个转化子,最终通过测序分析获得一株creB基因缺失菌株。结论:Split-marker重组技术是对烟曲霉creB基因进行敲除的快速有效的方法。获得的creB缺失菌株可用于基因功能研究。     

Stathmin1 RNA干扰载体的构建及功能检测

目的构建用于stathmin1 RNA干扰的重组质粒并验证其干扰效果,初步探讨stathmin1对于黑色素细胞生长的影响。方法两步PCR法构建含有shRNA编码序列的重组质粒,脂质体转染黑色素细胞。RT-PCR、Western印迹等方法检测stathmin1在黑色素细胞中表达水平改变;MTT、流式细胞仪等方法检测黑色素细胞生长状态。结果成功构建3个stathmin1特异性的RNA干扰载体,在黑色素细胞中能有效降低stathmin1在mRNA水平的表达,蛋白质表达水平分别降低为对照组的6％、17％和15％;黑色素细胞的生长由于stathmin1减弱表达而受到明显抑制,凋亡率提高到约60％。结论干扰质粒能有效介导stathmin1的RNA干扰;stathmin1对于黑色素细胞的生长具有重要意义。     

H1启动子siRNA载体的构建及应用

利用双链RNA(dsRNA)调控基因表达已经成为研究基因功能的有力工具。用人H1启动子构建了pBS／H1PS小干扰RNA(siRNA)表达载体,用于在哺乳动物细胞中产生特异性dsRNA转录产物。通过对293细胞中的PSMA7分子进行表达抑制,证明该siRNA载体能够有效产生针对靶基因的RNA干扰(RNAi)效应。     

小鼠XBP1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选

目的:构建小鼠XBP1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体,筛选具有较好干扰效率的小鼠XBP1 siRNA靶序列.方法:针对小鼠XBP1基因特异性序列,设计4个RNAi靶序列及1个阴性对照序列,合成含有正义和反义Oligo DNA的互补DNA序列,退火形成双链DNA,并克隆到经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,DNA测序鉴定.由病毒包装系统进行包装,经滴度测定后感染NIH3T3细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的寡核苷酸链插入正确,293T细胞测定病毒滴度为1×108TU/ml.Real-timePCR证实XBP1-siRNA-3靶点的干扰效率最高,其干扰效率达到95%以上.结论:成功构建并筛选了小鼠XBP1基因RNAi慢病毒载体,为研究XBP1在巨噬细胞免疫功能调控中的作用奠定了基础.     

Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.     

SUMO-1小干扰RNA的构建及其干扰效果检测

目的:构建小泛素相关修饰物-1(SUMO-1)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对SUMO-1基因表达的干扰效果。方法:根据SUMO-1基因序列设计一条合理的SUMO-1siRNA,并将其克隆到pSliencer2.1-U6neo载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建的SUMO-1siRNA重组质粒单独转染或与带HA标签的SUMO-1表达载体共同转染人胚肾293T细胞,收集细胞裂解物,以抗HA和SUMO-1的抗体用Western印迹检测siRNA的干扰效果。结果:构建了SUMO-1siRNA重组质粒,干扰效果可达80%以上。结论:构建的SUMO-1siRNA为进一步进行蛋白质SUMO-1化修饰的研究奠定了基础。     

大麦产量相关基因HvYrg1的克隆及植物RNA干扰载体的构建

大麦谷粒是受多个数量性状基因(QTL)控制的复杂性状,而RING E3泛素连接酶在决定大麦产量和蛋白质降解途径中起到极为重要的作用。本研究按照同源克隆的方法,依据水稻、拟南芥、玉米、小麦和酵母等E3泛素连接酶保守区域设计引物,采用RT-PCR方法从西藏大麦中克隆出产量相关基因HvYrg1全长cDNA序列,包括完整的开放阅读框架(ORF)1 275 bp,编码蛋白为424个氨基酸(GenBank No. EU333863)。同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的水稻GW2基因同源性最高为86%。以植物表达载体pCAMBIA2300-35s-OCS质粒为基础,构建由35s启动子调控的HvYrg1基因的RNA干扰载体pCAM-RNAi-HvYrg1。这一载体的成功构建为研究该基因在作物产量的功能鉴定打下了很好的基础。     

大鼠CB1基因真核表达载体的构建及其对CaSki细胞凋亡的影响

目的构建大鼠CB1(r CB1)基因真核表达载体,检测r CB1基因在细胞中的表达,研究r CB1对人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的影响。方法从大鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增r CB1基因,通过酶切、纯化、连接PCR纯化产物与p CDNA 3.1(+)质粒,构建pc DNA3.1(+)-r CB1。脂质体法将其转染到HEK293和Ca Ski细胞,Western blot及细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测r CB1的表达及定位,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot与实时荧光定量PCR检测r CB1、Bcl-2、Bax、Bad表达。结果酶切重组质粒获得5300 bp的载体片段和1500 bp的目的片段,测序结果和r CB1基因序列(NM_012784.4)一致。转染HEK293细胞后,r CB1在HEK293细胞细胞膜和细胞质表达。转染Ca Ski细胞后,r CB1使细胞凋亡率增加(P0.05);r CB1基因上调Bax、Bad的表达,同时抑制Bcl-2的表达,与空白组比较,其差异具有显著性(P0.05)。结论成功构建了pc DNA3.1(+)-r CB1真核表达载体,r CB1表达于细胞膜和细胞质,r CB1可以明显促进宫颈癌Ca Ski细胞凋亡,其机制是上调Bax、Bad和抑制Bcl-2表达。     

阳离子脂质体介导RNA干扰的效果评价

考察自制的肽型阳离子脂质体CDO14作为RNA转染载体的细胞毒性及其运载si RNA进行RNA干扰的效果。通过MTT法检测脂质体对稳定表达荧光素酶的肺癌A549(Luc-A549)细胞的毒性。以脂质体为载体将荧光素酶si RNA(Luc-si RNA)转染至Luc-A549细胞内,用发光仪检测转染细胞内荧光素酶含量,BCA法检测细胞内总蛋白含量。在裸鼠腋下接种Luc-A549细胞,成瘤后尾静脉注射Luc-si RNA和脂质体的复合物,利用活体成像系统检测模型小鼠体内荧光素酶的表达量。细胞毒性实验表明,自制脂质体的毒性与商品脂质体DOTAP相近,低于商品脂质体Lipo2000;细胞转染实验表明自制脂质体作为基因转染载体的转染效率高于DOTAP;体内转染实验表明CDO14作为载体转染效果优于DOTAP。结果表明,肽型阳离子脂质体CDO14具有毒性小、转染效率高等优点,有望作为转染载体用于基因治疗。     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

各种RNA干扰库的构建及比较

不同种类的RNA干扰库已经被用于基因功能的研究之中,根据其构建方式和分子形式的不同,可将RNA干扰库分为4种类型,即化学合成的小干扰RNA（siRNA）库、化学合成的小发夹RNA（shRNA）表达库、酶切法构建的siRNA库和酶切法构建的shRNA表达库。简要介绍上述RNA干扰库的构建方法及其特点和局限。     

针对小鼠早期生长反应因子-1发夹结构小干扰RNA载体的构建及其干扰效率鉴定

目的:构建及筛选高效率针对早期生长反应基因-1(Egr-1)进行RNA干扰(RNAi)的质粒.方法:根据Egr-1基因mRNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空栽体pGCSIL-GFP中,构建重组质粒,同时设计构建不针对任何特异基因的质粒作为阴性时照.将shRNA袁达质粒转粢HEK293细胞.通过对GFP表达量的观察,荧光定量PCR及western blotting定量检测Egr-1基因的表达,鉴定shRNA表达质粒对Egr-1的干扰效率.结果:针对小鼠Egr-1基因进行RNAi的3个序列中,有1个序列的干扰效率大于70%以上.结论:成功构建了1个针对小鼠Egr-1基因的高效RNAi表达质粒.     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建特异性抑制甲胎蛋白（AFP）的小干扰RNA（siRNA）表达载体,为进一步研究AFP基因功能及AFP相关肿瘤的基因治疗奠定基础。方法：设计并合成AFP特异性的短链寡核苷酸,退火形成双链DNA片段,通过与RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector连接、转化大肠杆菌、扩增、纯化得到所需质粒,用琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。结果：琼脂糖凝胶电泳证实纯化后的质粒大小约为6740bp,测序证实插入序列与合成的寡核苷酸序列完全符合。结论：构建了AFP特异性的siRNA表达质粒pSIREN-DNR—DsRed-Express Donor Vector-AFP。     

CDC6靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定

目的:构建小鼠CDC6基因的RNAi真核表达载体PGCsilencer TM u6/Neo/GFP/RNAi,观察其转染小鼠肝细胞前后CDC6的表达变化。方法:根据GenBank中CDC6的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencer U6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至正常小鼠肝细胞中,用RT-PCR检测CDC6的mRNA的表达及用Western blot方法检测CDC6蛋白水平的表达,并比较转染前后其表达水平的变化。结果:经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western blot方法检测,转染干扰质粒后,小鼠肝细胞中CDC6表达在mRNA及蛋白水平都有明显的下降。结论:成功构建了CDC6基因的RNAi真核表达载体并转染至小鼠肝细胞中,为下一步探讨CDC6在肝再生的作用奠定了基础。     

RNA干扰沉默低氧诱导因子-1α对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

本研究应用基因克隆技术,将合成的发卡样特异性低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1α）干扰寡核苷酸（siRNA）序列插入真核表达载体中,构建出特异性HIF-1α基因RNA干扰（RNAi）真核表达载体。采用组织块种植法,原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）,将构建出的特异性HIF-1αRNAi真核表达载体转染到PASMCs;分别在常氧和低氧下进行细胞培养,采用RT-PCR检测PASMCsHIF-1αmRNA表达水平,用MTT和流式细胞仪检测细胞增殖水平,探讨低氧条件下HIF-1αRNAi真核表达载体对PASMCs增殖的影响。结果表明,低氧培养48h后,正常PASMCs和转染了HIF-1αsiRNA阴性表达载体的细胞增殖显著,HIF-1αmRNA表达水平也显著升高;而转染了HIF-1αsiRNA阳性表达质粒的细胞增殖不显著,HIF-1αmRNA表达水平较低。结果提示：HIF-1αRNAi真核表达载体能显著干扰培养的PASMCsHIF-1αmRNA表达,同时抑制低氧环境下PASMCs的增殖。