巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的定点突变及其动力学性质研究

为了提高青霉素G酰化酶（PGA）在酸性及有机溶剂中的稳定性,以大肠杆菌的晶体结构为模板,用软件PMODELING同源模建巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构结构并且选择PGA分子表面的合适碱性氨基酸突变为丙氨酸,通过三种不同的快速PCR介导定位突变的方法,将位于PGA的α亚基21位、128位和β亚基492位、512位的赖氨酸残基分别突变为丙氨酸,获得四个突变酶Kα021A、Kα128A、Kβ492A和Kβ512A。其中Kα128A和Kβ512A保持与野生型相近的酶活力,其动力学性质如最适温度、最适pH,Km及Kcat没有明显变化;突变酶Kα021A和Kβ492A则丧失 了酶活力。上述结果表明,PGA分子表面非活性中心的赖氨酸→丙氨酸点突变使突变子的性状发生了分化,突变效应呈现出丰富的多样性。该有理设计不但可以提高酶的稳定性,而且为揭示PGA结构和功能的关系提供了一个新的研究模型。     

青霉素酰化酶固定化前后动力学行为的比较

在优化的固定化条件下,通过戊二醛交联直接将青霉素酰化酶固定化。在优化的环境条件下测定游离酶和两种固定化酶的动力学常数。结果表明,尽管固定化酶的米氏常数增大,但产物抑制作用减弱,裂解青霉素的实验结果表明,固定化酶更适合在工业上应用。     

硅藻土在青霉素G酰化酶提纯中的应用

国产硅藻土经氢氧化铵处理后可用于从发酰液中直接取青霉素Ｇ酰化酶,平均吸附量为９０Ｕ／ｇ。吸附的酶可用２２％硫酸胺－０．３ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ８．０）溶液洗脱。平均比活１８Ｕ／ｍｇ蛋白（ＮＩＰＡＢ法）。硅藻土可反复使用。苯乙酰胺－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ树脂可对酶作进一步的纯化。     

活性炭吸附固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶

目的：以活性炭为载体固定化粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶,考察固定化酶的性质。方法：对影响酶固定化的因素优化筛选,确定有显著影响的因素：pH、离子强度、酶量、固定化时间进行L934的正交实验,获得最佳固定化条件,并对固定化酶的最适反应温度、pH及批次稳定性进行研究。结果：最佳固定化条件为：载体0.3g,酶量5mL,总反应体系为12mL,离子强度1mol/L,温度4℃,pH 7.0,固定化40h;最高固定化酶活性为135.9U/g湿载体。固定化酶性最适反应温度为55℃,最适pH为10,重复使用12次后没有活性损失。结论：活性炭吸附固定化青霉素G酰化酶的活性高,批次反应稳定,具有工业应用潜力。     

重组巴斯德毕赤酵母发酵生产几丁质酶的条件优化研究

研究了利用重组巴斯德毕赤酵母诱导表达重组几丁质酶的条件。在摇瓶水平上研究了诱导时间、pH、甲醇流加量、油酸等因素对重组几丁质酶表达的影响。结果发现诱导108h蛋白表达量最高;偏酸性环境不利于蛋白表达,维持在pH5.5～6.0最佳;甲醇最佳诱导浓度为1%;添加0.05%的油酸有助于提高蛋白表达量。在此基础上通过正交试验设计优化了培养基配方,在优化条件下,蛋白表达量达171.99mg/L,酶活达49.58U/mL。     

一步法纯化青霉素G酰化酶

本文报导了用水平等电聚焦电泳技术由粗酶液一步纯化制得纯青霉素G酰化酶.     

青霉素G酰化酶基因Ser177的定点突变

本研究用缺口以链法对肠杆菌青霉素Ｇ酰化酶（ＰＧＡ）基因Ｓｅｒ１７７进行寡核苷酸定点突变。通过ＮＩＰＡＢ（２－硝基－５－苯乙酰胺苯甲酸）试纸法筛选和测序鉴定,获得突变体Ｃｙｓ１７７,Ｇｌｙ１７７,Ａｒｇ１７７和Ａｓｎ１７７。它们的ＰＧＡ活性均已丧失。酶蛋白电泳分析表明突变体蛋白在体内正常表达。推测ＰＧＡ Ｓｅｒ１７７秀可能位于酶底物结合中心,是酶活性所必需,不能被置换。     

定点突变提高青霉素G酰化酶的稳定性

以大肠杆菌青霉素G酰化酶的晶体结构为模板 ,用软件PMODELING同源模建巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构。在此基础上 ,将 β亚基 4 2 7位 (突变A)和 4 3 0位 (突变B)赖氨酸残基突变为丙氨酸 ,降低了该酶的等电点 ,增加了疏水性 ,从而提高其在酸性和有机溶剂环境中的稳定性。两个突变体与亲本相比 ,比活力和Km相近 ,最适pH减少了 0 .5个单位 ,突变B在 pH 5 .2的溶液中的稳定性明显提高。突变A和B在 15 %DMF中的半衰期分别比亲本酶提高了 60 %和 166%     

硅藻土在青霉素G酰化酶提纯中的应用

国产硅藻土经氢氧化铵处理后可用于从发酰液中直接取青霉素Ｇ酰化酶,平均吸附量为９０Ｕ／ｇ。吸附的酶可用２２％硫酸铵－０．３ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ８．０）溶液洗脱。平均比１８Ｕ／１８Ｕｍｇ蛋白（ＮＩＰＡＢ法）。硅藻土可反复使用。苯乙酰胺－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ树脂可对酶作进一步的纯化。     

重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件初步研究

为提高重组毕赤酵母(P.pastoris KM71/pPIC9K-bgl)生产β-葡萄糖苷酶的产量,在摇瓶条件下对重组P.pastoris产β-葡萄糖苷酶的发酵过程进行了优化,得到最佳的条件:生长阶段甘油浓度为30 g/L,接种量为10%,诱导阶段甲醇的初浓度为4%,过程补加甲醇0.5%,诱导温度30℃,pH7.5,诱导周期120 h,酶活可达到245 U/mL。在此基础上,在3 L发酵罐上进行初步放大,流加甘油提高细胞密度至OD_(600)为170,开始流加甲醇诱导,最终BGL酶活达到1 175 U/mL。比摇瓶提高了4.8倍,为β-葡萄糖苷酶工业化生产打下了坚实的基础。     

High-level production and covalent immobilization of Providencia rettgeri penicillin G acylase (PAC) from recombinant Pichia pastoris for the development of a novel and stable biocatalyst of industrial applicability

A complete, integrated process for the production of an innovative formulation of penicillin G acylase from Providencia rettgeri(rPAC(P.rett))of industrial applicability is reported. In order to improve the yield of rPAC, the clone LN5.5, carrying four copies of pac gene integrated into the genome of Pichia pastoris, was constructed. The proteinase activity of the recombinant strain was reduced by knockout of the PEP4 gene encoding for proteinase A, resulting in an increased rPAC(P.rett) activity of approximately 40% (3.8 U/mL vs. 2.7 U/mL produced by LN5.5 in flask). A high cell density fermentation process was established with a 5-day methanol induction phase and a final PAC activity of up to 27 U/mL. A single step rPAC(P.rett) purification was also developed with an enzyme activity yield of approximately 95%. The novel features of the rPAC(P.rett) expressed in P.pastoris were fully exploited and emphasized through the covalent immobilization of rPAC(P.rett). The enzyme was immobilized on a series of structurally correlated methacrylic polymers, specifically designed and produced for optimizing rPAC(P.rett) performances in both hydrolytic and synthetic processes. Polymers presenting aminic functionalities were the most efficient, leading to formulations with higher activity and stability (half time stability >3 years and specific activity ranging from 237 to 477 U/g (dry) based on benzylpenicillin hydrolysis). The efficiency of the immobilized rPAC(P.rett) was finally evaluated by studying the kinetically controlled synthesis of beta-lactam antibiotics (cephalexin) and estimating the synthesis/hydrolysis ratio (S/H), which is a crucial parameter for the feasibility of the process.     

发酵重组Pichia pastoris生产腺苷甲硫氨酸的研究

在5L发酵罐中对高产S腺苷甲硫氨酸的重组Pichia pastoris发酵进行了研究。重组菌在pH5．0生长,然后调为pH6．0积累腺苷甲硫氨酸,在30℃、溶氧5％及流加甲硫氨酸和尿素的条件下培养82h后,产量达4．3g／L。     

海参i-型溶菌酶在毕赤酵母基因工程菌中优化表达及纯化

将实验室已构建的毕赤酵母基因工程茵(pPIC9K-SjLys/GS115)作为海参i-型溶茵酶生产菌株,本研究分别从甲醇浓度、培养基pH、温度和诱导时间对其产酶发酵条件进行优化.实验得出甲醇诱导浓度为1.0％,发酵培养基初始pH 6.0,温度30℃,培养96 h为最佳目的蛋白表达条件,其发酵液中海参i-型溶菌酶含量达10.63 mg/L.将发酵液经离心和超滤浓缩后得到上清液,再经离子交换和凝胶过滤层析纯化获得海参i-型溶菌酶产品,其酶活力达826.44 U/mg.经测定该酶对革兰氏阳性菌溶壁微球菌和革兰氏阴性菌副溶血弧菌均具有明显的抑菌作用.     

响应面分析优化产木聚糖酶毕赤酵母基因工程菌培养条件

研究不同碳源、氮源和无机盐对毕赤酵母AX181菌株产木聚糖酶的影响。实验表明,分别采用葡萄糖和玉米浆干粉为碳源和氮源可以明显提高木聚糖酶的产量。无机盐单因子优化实验显示添加适量的（NH4）2SO4、KH2PO4、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O也可以部分提高木聚糖酶产量。在此基础上利用响应面法优化毕赤酵母产木聚糖酶培养基,利用12次实验的Plackett—Burman设计实验筛选出影响产木聚糖酶的3个主要因素,即玉米浆干粉、MnSO4·H2O和FeSO4·7H20。并进一步通过最陡爬坡路径逼近最大响应区域,采用中心组合实验设计确定最佳条件。优化后的产木聚糖酶培养基组分为（g/L）：葡萄糖40．00,玉米浆干粉80．84,（NH4）2SO46．25,KH2PO41．25、MnSO4·H2O0．35,FeS04-7H2O1．31。培养基优化后,实际产酶2883．86u／mL,是优化前YPD培养基产酶的2．51倍。     

A competitive enzyme linked immunosorbent assay for recombinant Bm86 produced in Pichia pastoris

A competitive enzyme linked immonosorbent assay (ELISA) was developed for quantification of recombinant Bm86 protein (rBm86), antigen of the vaccine GavacTM against the cattle tick Boophilus microplus. Monoclonal antibody (Mab) SSBm1 showed identical recognition to folded and denatured antigen and was used in the competition assay. This ELISA was sensitive enough to detect 60 ng/ml of rBm86. Within-assay coefficient of variation was 5.7 to 6.2 % and between-assay variation was 7.7 to 11.6 %. The level of expression of recombinant Bm86 in Pichia pastoris reached about 2.7 g per liter of culture after 80 hour of fermentation. © Rapid Science Ltd. 1998     

Sorbitol as a non-repressing carbon source for fed-batch fermentation of recombinant Pichia pastoris

Glycerol/methanol and sorbitol/methanol mixed-feed fermentation strategies for the production of recombinant proteins by Pichia pastoris were compared in order to examine sorbitol's potential as a carbon source. Although P. pastoris does have a lower cell yield on sorbitol than on glycerol, the specific rate of product formation is higher (60 g protein g^–1 dry wth for sorbitol/methanol, vs 45 g protein g^–1 dry wth for glycerol/methanol), resulting in comparable final recombinant expression levels. Importantly, the presence of residual sorbitol in the growth medium appears to be less repressive to the alcohol oxidase promoter in this organism, providing a more forgiving means of operating mixed-feed fed-batch recombinant P. pastoris fermentations.     

双碳源流加对重组毕赤酵母高效表达葡萄糖氧化酶的影响

葡萄糖氧化酶(GOD)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了实现葡萄糖氧化酶的高效生产,提高重组毕赤酵母生产GOD的产量和增强生产强度,对重组毕赤酵母诱导阶段的初始菌体浓度和甲醇浓度进行了优化.在此基础上,诱导期采用了双碳源(甘油、山梨醇和甘露醇)与甲醇混合流加的模式.研究发现,最佳诱导前初始菌体浓度和甲醇浓度分别为100 g/L和18 g/L,此时GOD产量为427.6 U/mL.在诱导阶段采用甘油、山梨醇和甘露醇与甲醇的混合添加均可以提高GOD产量,其中甘露醇与甲醇的混合流加效果最为显著.当甲醇与甘露醇混合流加的比例为20∶1(W/W)时,诱导156h GOD产量和生产强度分别可达711.3 U/mL和4.60 U/(mL·h),比甲醇单一流加策略结果分别提高了66.3％和67.9％.此外采用合适的甘露醇混合流加策略不但不会抑制AOX1启动子的表达,甚至有一定促进作用,AOX酶活性为8.8 U/g(对照为5.2 U/g).双碳源流加方式还能推广到毕赤酵母其他表型中,为该系统高效表达外源蛋白提供一种新策略.     

重组毕赤酵母发酵生产S-腺苷甲硫氨酸培养条件优化

甲醇营养型毕赤酵母生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是通过其表达的SAM合成酶催化L-甲硫氨酸(L-Met)和ATP反应而合成的。本文采用全合成培养基,在摇瓶上进行了培养条件的优化,确定了接种量、pH、PTM1、PO43-等初步条件。并根据SAM生物合成的特征,重点对其碳、氮源的影响作了进一步的分析优化。结果表明:当CaSO40.465g/L,K2SO49.10g/L,MgSO4.7H2O 7.45g/L,PO43-0.5mol/L情况下,生长阶段,甘油4%、硫酸铵4.00g/L为最佳;诱导表达阶段,L-Met1.0g/L,甘油与甲醇比例为0.5、硫酸铵8.00g/L为最佳。优化后,SAM产量诱导4d后达1.48g/L,诱导5d后可达1.70g/L(131mg/g干细胞),L-Met的转化率可达40.65%,既利于工艺放大又便于产品的分离纯化。     

重组巴斯德毕赤酵母发酵生产内切几丁质酶的培养条件优化

探讨重组巴斯德毕赤酵母发酵生产内切几丁质酶的最适培养条件,以期获得最佳的内切几丁质酶活力。以内切几丁质酶活力为指标,通过部分因子试验设计以及响应面法优化确定重组巴斯德毕赤酵母高产内切几丁质酶的最适培养条件。部分因子试验设计筛选的影响重组巴斯德毕赤酵母高产内切几丁质酶的3个关键因子为甲醇、油酸和吐温-80。响应面法优化的上述3个关键因子的最佳浓度分别为0.71%、0.086%和0.31%。重组巴斯德毕赤酵母发酵生产内切几丁质酶的最适培养条件为：酵母膏1%、酵母氮碱（YNB）1.34%、蛋白胨2%、甲醇0.71%、油酸0.086%、吐温-80 0.31%、PTM₁ 0.8%、pH 6.0。在上述培养条件下,重组巴斯德毕赤酵母产内切几丁质酶的活力高达30.92U/mL。与未优化前相比,酶活力提高了1.44倍。研究结果为内切几丁质酶的产业化生产和应用奠定了良好基础。     

Rapid continuous colorimetric enzyme assay for penicillin G acylase

A rapid, continuous, colorimetric enzyme assay for penicillin G acylase has been developed. The assay measures the formation of the acidic products of penicillin G hydrolysis by following the decrease in pH using Phenol Red as an indicator. The activity measured is directly proportional to the amount of enzyme added to the assay, having a linear relationship with an R ² value of 0.9994.