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1.
外源p21~(WAF1)转染对人成纤维细胞凋亡的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
构建了有义和反义p21WAF1 逆转录病毒表达载体, 分别经脂质体包裹后转染人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)。Southern 印迹杂交证实转染细胞中外源p21 WAF1cDNA 已整合入基因组中。与空载体转染细胞相比, 有义转染细胞的p21WAF1 m RNA 表达上升; 细胞增殖速度明显减慢; 对丁酸钠诱导凋亡的敏感性降低, 表现在细胞存活率升高, 核DNA 梯状断裂片段出现的时间滞后, 断裂片段浓度下降, 流式细胞计检测的凋亡峰面积缩小。而反义转染细胞的p21WAF1 m RNA表达下降; 细胞增殖速度较快; 对丁酸钠诱导凋亡的敏感性上升, 有关表现与有义转染细胞相反。说明2BS细胞内p21WAF1 的表达量与其被丁酸钠诱导凋亡的能力呈负相关。 相似文献
2.
对重组蛋白上皮调节蛋白(epiregulin,EPI)抑制表皮癌细胞A431的生长机制进行了初步的探讨。通过Northern杂交发现,细胞受到重组蛋白质刺激后,其周期蛋白激酶的抑制因子p21^WAF1/CIP1的mRNA含量有较明显的提高。报告基因分析表明,p21^WAF1/CIP1启动子区的转录因子STAT1结合序列对EPI的刺激有较强的反应。流式细胞仪的测定则表明,在EPI导致的细胞生长抑制中 相似文献
3.
用反转录PCR从正常人胚胎肺细胞中获得了p21基因cDNA,将其插入真核表达载体pMSCVneo,构建成重组质粒,pMS21,并将其转染至肺癌细胞株A549.通过集落形成观察到p21对肺癌细胞具有明显的抑制作用,经RNA狭缝杂交、West-ernblot分析和免疫细胞化学实验证实这是p21表达的结果.荷瘤裸鼠实验也进一步证实了p21对肺癌细胞具有明显的抑制作用.为p21的深入研究提供了基础. 相似文献
4.
p21基因的克隆及其对肺癌细胞生长的抑制 总被引:2,自引:0,他引:2
用反转录PCR从正常人胚胎肺细胞中获得了p21基因cDNA,将其插入真核表达载体pMSCVneo,构建成重组质粒,pMS21,并将其转染至肺癌细胞株A549。通过集落形成观察到p21对肺癌细胞具有明显的抑制作用,经RNA狭缝杂交、Western blot分析和免疫细胞化学实验证实这是p21表达的结果。荷瘤裸鼠实验也进一步证实了p21对肺癌细胞具有明显的抑制作用。为p21的深入研究提供了基础。 相似文献
5.
大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究 总被引:4,自引:0,他引:4
735bp的PRLcDNA片段从质粒PRL-SP65#1中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体pcDNA3上,筛选出正向连接重组体pcDNA3-PRLS和反向连接重组体pcDNA3-PRLAS。将重组体pcDNA3-PRLs和空载体pcDNA3分别转入NIH3T3细胞系,用G418筛选出阳性细胞后与未转染的NIH3T3细胞在加E2和不加E2的情况下,用原位杂交的方法,分别用PRLcDNA探针和原癌基因c-H-rascDNA探针进行检测,未转染的NIH3T3细胞在加E2和不加E2时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的NIH3T3细胞也无PRL的表达,而转入重组体pcDNA3-PRLS的NIH3T3细胞则有大量的PRL基因的表达,与对照组相比有显著差异(P<0.01)。正常和转入空载体的NIH3T3细胞有一定程度的原癌基因c-H-ras的表达,当分别加入E2和转入重组体pcDNA3-PRLS后,NIH3T3细胞中的c-H-ras基因表达水平都显著升高(P<0.05)。 相似文献
6.
淀粉样前体蛋白(APP)是阿尔茨海默氏病(AD)病因学中重要的分子,但其正常的生理功能尚不清楚.为了研究细胞内过量产生其各种片段对细胞生理机能的影响.将人APP695cDNA中编码C端105个氨基酸残基的DNA片段重组到真核表达载体pDORneo中形成重组质粒pDOR-neo-CT.然后用脂质体将其转染到人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中.用800μg/mlG418筛选获得了在mRNA和蛋白质水平均表达相应片段的稳定细胞系.MTT和LDH分析表明,APPC端的表达未能对SH-SY5Y细胞产生明显的毒性作用. 相似文献
7.
hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达 总被引:4,自引:1,他引:3
研究了骨形态发生蛋白BMP-2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从pSPS65BMP-2质粒中回收BMP-2cDNA,删除5端的非翻译序列,插入pSVL载体中,构建了含有BMP-2全长编码序列的重组表达质粒pSVLBMP-2将表达质粒导入COS-7细胞中,细胞RNA点杂交结果表明,转染BMP-2基因的细胞内BMP-2的mRNA水平明显升高,细胞培养上清的ELISA显示,转染BMP-2c 相似文献
8.
利用RT-PCR方法,从小鼠肝脏组织总RNA中扩增出4.5SRNA的cDNA。该cDNA被克隆到pGEM3Zf(+)质粒上,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以Luc基因作为报道基因的表达载体pSVluc20的PvuⅡ位点,构建了含4.2SRNA逆转座子的表达载体pSVluc20-4.5S。脂质转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0和人乳腺癌细胞Bca61。结果表明,小鼠4.5SRN 相似文献
9.
HCV NS5B基因片段克隆入BAC-TO-BAC^TM重组杆状病毒表达系统的pFASTHTc载体质粒,转化DH10BAC^TM感受态细菌获得重组的Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf细胞,获得的重组杆状病毒可表达目的蛋白。免疫印迹和体外活性检测表明,所表达蛋白为HCV NS5B蛋白,具有多聚酶活性。 相似文献
10.
研究了骨形态发生蛋白BMP-2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从pSPS65BMP-2质粒中回收BMP-2cDNA,删除5'端的非翻译序列,插入pSVL载体中,构建了含有BMP-2全长编码序列的重组表达质粒pSVLBMP-2。将表达质粒导入COS-7细胞中,细胞RNA点杂交结果表明,转染BMP-2基因的细胞内BMP-2的mRNA水平明显升高;细胞培养上清的ELISA显示,转染BMP-2cDNA后,细胞分泌产生的BMP-2显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入BMP-2重组质粒后,局部组织内BMP-2的mRNA转录水平也明显提高。 相似文献
11.
FEN—1基因反义阻断细胞株(FL—FEN—1^—)的建立 总被引:2,自引:0,他引:2
FEN-1是一咱结构特异性核酸酶,它在DNA复制和修复过程中都起着重要的作用。将FEN-1基因的NcoI-BamHI片段反向克隆到哺乳动物细胞重组表达质粒pMAMneoAmp^-中,得到FEN-1反义表达质粒pMAMneoAmp^-FNB^-,并转染FL细胞,经G418筛选后,获得FEN-1基因表达被阻断的哺乳动物细胞FL-FEN-1^-。对细胞生长曲线的测定发现,FL-FEN-1^-在地塞米松的 相似文献
12.
将质粒pBX-MT上的小鼠MT-ⅠcDNA片段切下作为模板,通过PCR方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒pBS-SK中,经DNA序列测定后证明其克隆序列正确.再将MT-ⅠcDNA编码序列插入到转移载体pBacPAK8的BamHⅠ和EcoRⅠ位点之间,通过磷酸钙/DNA共转染方法将其导入昆虫细胞Sf9中,以Westernblot和DotEIA方法对表达产物进行了检测,表达量为1mg/L 相似文献
13.
体外研究汉滩病毒(HTNV)S基因及其5'端表达的意义,为核蛋 白T细胞表位的研究奠定基础。设计2套引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出S 基因全读码框(37-1326bp)及S基因5'端(37-501bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体,并通过脂质体转 染至Vero细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N在Vero细胞中的表达。pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体有较高的转染效率,目 的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义。 相似文献
14.
人IL-18 cDNA克隆及其真核表达质粒的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
用RT-PCR技术从健康人外周血单核细胞的总RNA中扩增出编码白细胞介素18的全长cDNA,并将此基因定向克隆入真核表达质粒载体pcDNA3中,通过对转化子的筛选得到了带有IL-18插入片段的阳性克隆,经酶切分析及核苷酸测序表明,克隆到的基因与文献报道的完全一致。把重组质粒pcDNA3/IL-18分别转染人肝癌细胞HepG2和鼠肉瘤细胞S180,在mRNA水平检测到IL-18的表达,但IL-18 的表达未诱导肿瘤细胞产生IFN-γ。 相似文献
15.
抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
将抗真菌蛋白Rs-AFP1和Rs-AFP2全长cDNA插入表达质粒pET-22b/NcoI+SacI位点,构建成融合蛋白表达载体pRAF1和pRAF2.将不含信号肽编码序列的Rs-AFP1和Rs-AFP2cDNA分别插入pET-22b/Ncol+Sacl和pET-22b/Ndel+SacI位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体pRAF3、pRAF4和非融合蛋白表达载体pRAF5和pRAF6.将构建的上述各种表达载体转化E.coliBL21,挑菌落培养,IPTG诱导,使Rs-AFPs基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,pRAF3和pRAF4表达产物的抑菌活性较明显. 相似文献
16.
采用PCR点突变技术,构建含有细菌荧光酶融合luxAB报告基因的重组哺乳动物载体pcDNA3-luxAB,脂质体lipofectin转染和G418抗性筛选稳定转染的Hela细胞。PCR和酶切电泳证明构建的正确性;经稳定转染pcDNA3-luxAB的Hela细胞,用发光仪可测得较强的发光强度(最大值为4.12mV/40μg细胞总蛋白粗提物)。而亲本及pcDNA3稳定转染的Hela细胞则在本底值范围,pcDNA3-luxAB稳定转染与亲本及pcDNA3稳定转染的Hela细胞在细胞形态和培养条件等方面无明显差异。本工作为细菌荧光酶作为报告基因在肿瘤细胞中的表达和应用建立了基础。 相似文献
17.
应用cDNA文库快速构建法克隆高粱肌动蛋白基因 总被引:3,自引:0,他引:3
取生长一周的高粱嫩叶为材料,按照cDNA库快速构建法,用λgt10为载体成功地获得了含有2×10^06人重组噬菌体的cDNA库。以水稻RAcl cDNA为探针,经噬菌体原位杂交筛选出两个阳性克隆片段,并对其中一个进行了Southern杂交鉴定。然后将重组体中含有的cDNA片段亚克隆至pBluescript SK-载体上测序。 相似文献
18.
利用PCR技术,从正常人胎肝染色体DNA中克隆到长度为1572bp的人促红细胞生成素(EPO)基因组基因片段,它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成13bp外显子1的编码区,并与1572bp片段拼接,从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的EPO基因插入载体pSV2-dhfr得到pSV2-EPO表达载体,转染COS-7细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人EPO单抗及兔抗人EPO多抗,对表达产物进行ELISA定量测定,细胞分泌EPO量高达251±7U/ml.Krystal法测得体外生物活性241.5±6.5U/ml.用EPO单抗免疫沉淀结合SDS-PAGE对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定,清晰地看到了EPO条带。从高效表达EPO的转染细胞中分离纯化mRNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到EPO的cDNA,这为EPO在其它系统中的表达及EPO的功能与结构的研究打下了基础。 相似文献
19.
丙型肝炎病毒核酸疫苗的免疫效果观察 总被引:3,自引:1,他引:2
将丙型肝炎病毒C+E1区基因克隆到不同的真核细胞表达载体pCDNA3.1(+)和pSVL中,通过肌肉注射和皮下注射免疫BALB/C及F1小鼠后,产生了抗HCV/C区抗体。其中核酸疫苗pcDNA3.1-HCV/C+E1的免疫高峰的出现早于pSVL-HCV/C+E1,F1小鼠的抗体应答强于BALB/小鼠。肌肉注射优于皮下注射。 相似文献
20.
反义凝血酶受体基因的表达对人ASMC增殖的影响 总被引:3,自引:0,他引:3
介入治疗后再狭窄的发生严重降低了该治疗手段的最终疗效.为探讨再狭窄的发生机理、寻找有效的预防手段,利用反义RNA技术构建了含有部分反义凝血酶受体(ATR)cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3/ATR,并观察了其对培养的人主动脉平滑肌细胞(ASMC)增殖的影响.结果表明pcDNA3/ATR的瞬时转染即能显著抑制人ASMC的3H-TdR参入量,且该作用与导入的DNA量呈剂量依赖性.说明部分反义凝血酶受体基因的表达可以抑制ASMC的增殖 相似文献