柑桔裂皮类病毒和菊花矮化类病毒互补DNA探针的合成及检测

分别用人工合成的柑桔裂皮类病毒和菊花矮化类病毒的互补DNA探针,经固相分子杂交(dot blot)检测了柑桔、菊花等样品。结果表明:与生物学检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析相比,这是早期诊断类病毒病和检测类病毒的一种较为灵敏、快速的方法。     

菊花矮化类病毒cDNA的分子克隆

菊花是世界上重要花卉品种之一,由菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid,CSV)引起的矮化病,近些年来在一些国家中有不断扩展的趋势。由于类病毒感染的潜伏期较长,所以早期诊断十分重要。我们曾用互补DNA(cDNA)探针和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测我国的菊花矮化类病毒。分子杂交技术检测类病毒比生物学方法快速,较电泳方     

利用深度测序技术发掘植物病毒资源

第二代测序技术(NGS)因其快速和灵敏的检测特点已成为植物病毒学研究的强有力工具.NGS具有非序列依赖性的优势,能同时检测植物样品中可培养和不可培养的、含量高及含量低的所有的DNA病毒、RNA病毒以及类病毒,它的出现极大地变革和推进了病毒的发现历程.利用该技术已在多种植物上进行了植物病毒的发掘和病原鉴定,取得了非常好的效果.本文围绕NGS及其在植物病毒发掘中的应用研究和前景进行概述和展望.     

属级芯片筛查技术在马铃薯纺锤块茎类病毒属检测中的应用

建立马铃薯纺锤块茎类病毒属(Pospiviroid)类病毒有效的芯片筛查技术,对该属类病毒进行筛查。分析了该属类病毒序列,得到19条具有属级鉴定特征的探针。这些探针符合GC含量在40%与60%之间、单个核苷酸含量不大于50%、无多于4个核苷酸的连续重复及不形成多于6个核苷酸的发卡结构的标准;将探针点制到玻璃片基上制备芯片。芯片探针有效性实验结果表明,菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid,CSVd)及番茄雄性株类病毒(Tomato planta macho viroid,TPMVd)样品杂交可获得有效信号;灵敏度实验结果表明,该芯片可检测到200 pg/μL的总RNA。该芯片可用于Pospiviroid类病毒的筛查。     

一种有效的分离制备柑桔裂皮病类病毒的方法

类病毒分子量小,在寄主体内含量低,不易提纯。一般提纯方法需经过酚抽提,去糖、透析、氯化锂处理、DNase消化和纤维素层析,由于步骤复杂,所以回收率较低,同时所得样品纯度不高,难以满足各种需要。本文报道一种柑桔裂皮病类病毒(CEV)的分离制备方法,采用苯酚-氯仿抽提核酸,核酸经LiCl处理后,进行纤维素(CF-11)层析,然后经PAGE纯化CEV。该方法具有操作简便,所使用的设备简单,纯化CEV效果好等优点,是柑桔裂皮病类病毒早期诊断,序列分析,分子克隆和防治等研究必不可少的基础工作。     

我国菊花褪绿斑驳类病毒鉴定

从我国广州地区发现的带有褪绿斑驳症状的“广白”菊花病株中分离到一种小分子核酸,经鉴定其性质与国外报道的菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum Cholrotic Mottle Viroid,ChCMV)的性质完全一致。病株用酚提取后的粗核酸和制备的纯核酸经正反双向或垂直双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明为具有单链环状的RNA分子,其分子量与菊花矮化类病毒(Chrysanthemum Stunt Viroid, CSV)的相似。根据病株症状、寄主范围以及分段自我杂交等试验分析,证明这种小分子核酸是类病毒——chcMV,而不是CSV。在检测过程中,我们改进了提取和鉴定类病毒的方法,并建立了可以区分不同种类病毒的分段自我杂交技术。     

亚病毒

亚病毒(subviruses)是一类比病毒更为简单,仅具有某种核酸不具有蛋白质,或仅具有蛋白质而不具有核酸,能够侵染动植物的微小病原体。亚病毒包括三个类群:类病毒(viroid),拟类病毒(virusoid)和朊病毒(virino)。(见表1) 亚病毒作为病毒学的一个新分枝,是1983年在意大利召开的“植物和动物亚病毒病原:类病毒和朊病毒”国际会议上才正式确定的。     

小麦芽依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ不能转录绒毛烟斑驳病毒及其拟病毒

小麦芽经过匀浆、沉淀、高速及超速离心、透析以及DE_(52)离子交换层析等步骤,纯化小麦芽依赖于DNA的RNA聚合酶。用α-鹅膏蕈碱抑制试验,证明得到RNA聚合酶Ⅱ。用此聚合酶Ⅱ组建的体外转录体系的研究结果表明,绒毛烟斑驳病毒的拟病毒和卫星RNA(黄瓜花叶病毒相关RNA_3)都不能利用该体系进行转录,类病毒PSTV可进行转录,但转录效率明显低于小牛胸腺DNA;α-鹅膏簟碱可抑制类病毒的转录。绒毛烟斑驳病毒拟病毒和卫星RNA都不能被转录,表明他们的复制方法与类病毒不同。     

绒毛烟草斑驳病毒和莨菪斑驳病毒互补DNA的体外合成

有关病毒、类病毒分子结构性质和复制机理的研究进展日益要求组建基因库。鉴于RNA 的特性,其分子克隆的关键是要得到双链 cDNA,以与载体 DNA 重组、扩增,从而研究病毒、类病毒的分子结构及其基因表达等。合成的 cDNA 单链掺有放射性同位素,可用作分子探针,寻找不同病毒、类病毒间或株与株间的同源性,检测健株与感染植株中病毒或类病毒的特异序列。绒毛烟草斑驳病毒(Velvet tobacco mottle virus,简称 VTMoV)     

柑桔裂皮类病毒感染——爪哇三七的研究

爪哇三七(Gynura aurantiaca)是柑桔裂皮类病毒(CEV)的敏感鉴定植物之一,也是CEV能得到大量增殖的寄主植物。本文报告了采用反向双相聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色法和分子杂交技术,对CEV感染爪哇三七的若干特性的研究结果表明:感染了CEV的爪哇三七,无论是否表明症状,都比健株要多一条CEV-RNA带;感染了CEV的爪哇三七核酸提取物与CEV-cDNA探针能产生杂交点,而健株的核酸提取物则不能。以感病爪哇三七植株上发病的芽,再进行剪插,其病症的表现与光照有关,但经电泳检测CEV-RNA带的存在与病症表现无关。生物鉴定是对病毒及类病毒进行鉴定的经典方法。人们发现芸香科(Rutaceac)的香橼(Citron)等对柑桔裂皮病类病毒(CEV)敏感。此外,菊科(Compositae)的爪哇三七(Gynura aurantiaca)是对CEV敏感的草木植物之一。国内从部分地区田间柑桔裂皮病症状的调查和以香橼为指示植物鉴定CEV发生情况等研究都已有报道,但要对CEV的理化性质和分子生物学性质作深入研究,搞清楚CEV的致病机理及复制方式,并找到防治CEV的有效对策,首先需要大量高纯度的CEV-RNA,而直接从柑桔叶片中提取CEV则相当困难。爪哇三七不仅是CEV的敏感鉴定植物,可用于柑桔裂皮病的早期生物诊断,同时也是CEV大量增殖的理想寄主。为此,已有学者从CEV影响爪哇三七插条生根,使植株整体变化到CEV引起爪哇三七细胞病变,以及CEV引起爪哇三七蛋白质的变化等都作了细致的研究和报道。近年来,类病毒的研究方法又有新的进展,除了用简便的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)甲苯胺兰染色法外,又采用了灵敏的反向双相PAGE银染色法来检测类病毒。我们采用双相PAGE银染色法和分子杂交技术,进一步考察了CEV感染爪哇三七的若干特性,其结果报告如下     

3种菊花病毒/类病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的构建与准确性评价

菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量。为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottle viroid,CChMVd)的实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究分别以保守区域作为靶标设计相应的引物探针,通过优化扩增体系中CVB、TAV、CChMVd 3种病毒/类病毒探针浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度,摸索扩增程序中反转录时间、退火温度和扩增循环数,构建了一种可同时用于CVB、TAV、CChMVd的3重实时荧光定量RT-PCR检测体系,优化后的扩扩增体系中CVB、TAV和CChMVd的探针浓度分别为100 nmol/L、120 nmol/L和80 nmol/L,引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和160 nmol/L,Mg²⁺浓度为3.0 mmol/L;dNTPs浓度200μmol/L;最适反转录时间为25 min,退火温度为60℃,循环数为40。敏感性实验结果表明,该反应体系对3种病毒/类病毒的敏感性为1.0×¹⁰3拷贝/mL,敏感性好;定量线性范围为1.0×¹⁰3拷贝/mL~1.0×¹⁰10拷贝/mL,线性范围宽;特异性好,对菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒核酸检测结果为阴性;对1.0×¹⁰4拷贝/mL的低浓度参考品平行检测10次,定量结果lg值偏差(CV%)为4.81%,重复性好。在南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"基地随机选择菊花20株进行本研究试剂检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,其病毒载量为2.5×¹⁰4拷贝/mL~5.5×¹⁰7拷贝/mL,随机选择1株CVB病毒株定量PCR,产物进行TA克隆后经测序与NCBI Blast比对,其与MH678704.1的同源性为100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB、TAV、CChMVd 3种菊花常见病毒/类病毒的灵敏、快速、可定量的检测方法。     

菊花5种病毒及类病毒多重RT-PCR检测方法的建立

菊花是世界最重要的园艺作物之一,兼具有茶用、药用、食用及观赏等多种经济价值。我国是栽培菊花的起源地,也是主要种植生产区。病毒病害是菊花生产过程中最主要病害,目前已知的菊花病毒及类病毒有20多种,对菊花产业危害巨大。建立快速、高效的检测方法是病害防控的必要条件。前期调查显示番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus,TAV）、菊花B病毒（Chrysanthemum virus B,CVB）、菊花矮化类病毒（Chrysanthemum stunt viroid,CSVd）和菊花褪绿斑驳类病毒（Chrysanthemum chlorotic mottle viroid,CChMVd）是北京地区菊花中主要病毒及类病毒种类。自NCBI数据库下载以上病毒/类病毒的基因序列,利用不同病毒保守区域,设计开发出特异性引物,建立了5种病毒/类病毒同时检测的多重RT-PCR体系;并对反应体系中引物对的含量配比、退火温度、模板含量等因子进行了优化。试验结果显示,TSWV、TAV、CVB、CChMVd、...     

柑桔树中的一种小分子RNA

从柑桔裂皮病疫区采集的柑桔植株叶片中提取核酸,经双方向聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,发现两种小分子环状RNA,采用分子杂交鉴定,此两种小分子RNA均与大多数类病毒中心保守区段有明显的序列同源性,其中一种分子量较柑桔裂皮病类病毒(CEV)小,与马铃薯纺锤体块茎类病毒(PSTV)大小相近。将含CEV和小分子RNA的柑桔叶汁接种于爪哇三七,经一定时间后,从爪哇三七中提取核酸,通过电泳和分子杂交方法分析,获得与柑桔植株相同的结果。对此种小分子RNA的性质本文进行了初步分析。     

RT-PCR一步法检测甲型肝炎活病毒方法的建立

建立灵敏、特异、快速检测甲型肝炎活病毒(HAV)的方法。提取HAV总RNA,选用HAV高保守区为目标区,设计合成一对引物,通过RT-PCR反应扩增其核酸,用琼脂糖凝胶电泳法检测其扩增产物,紫外灯下观察,约200bp处为目标片段,根据观察结果,计算HAV滴度。RT-PCR一步法快速、灵敏、重复性好、特异性强,可用于甲型肝炎活病毒检测。     

最小的生命体——类病毒

类病毒是已知生物中最小的一类非细胞结构的病原微生物,具体地说是分子量较低的RNA或DNA分子所构成的生命体。类病毒不象病毒那样有衣壳包着,是最小的、裸露的、结构独特的核酸生物,主要存在于某些高等植物中,并使之罹病。类病毒由美国农业部植物病毒实验室类病毒研究组T.O.Diener博士在十年前首先发现。尽管类病毒非常小而简单,但是能在敏感宿主中进行自我复制,存在着基本的生物学的和遗传学的体系。由于类病毒在某些宿主中容易造成明显的病征而被发现,当然也有些种类的类病毒在复制时,常常不对宿主产生明显的破坏。在试图提纯和定性马铃薯纺锤体块茎病的病原体时,就首先发现了类病毒,但是多年来一直把这种病原体当作是病毒。Diener和Raymer(1967)曾报告这种疾病的传递因子是一种游离的RNA,因为在感病组织中没有发现病毒的核蛋白颗粒。直到1971年,Diener用沉淀和凝胶     

接种外表健康的梨树芽片诱发苹果锈果病类病毒

曾报道苹果锈果病的病原为类病毒,称为苹果锈果类病毒(Apple Scar SkinViroid,ASSV)。在分类上与已知的几组类病毒均不同,其侵染性也已得到证实。50年代已观察到由梨树园改栽的苹果园,或梨树与苹果混栽的果园中,苹果锈果病发病率较高,但梨树却未见任何症状。其后,曾用十几个品种的梨(包括产于未栽过苹果的梨产     

亚病毒——病毒学的一个新分支

1971年美国的Diener发现马铃薯纺锤形块茎病是由分子量仅为1.2×10~5的、具有很高碱基配对的单链环状RNA引起的,称谓“类病毒” (Viroid)。这一发现揭示了自然界存在着比病毒更简单的病原物。后来在许多经济植物上不断报道新的类病毒,在澳大利亚又发现,类似类病毒的环状RNA还能与类似病毒的线状大RNA共同包被于线状RNA编码的外     

病毒是进化的还是退化的产物?

答:自然界中被发现的病毒已逾千种(估计占总种数的1％)。关于它们是进化还是退化产物的问题,在70年代前一直争论不休。直到1972年,Diener发现类病毒之后,学者们才基本上统一了看法。普遍认为:非生命物质首先进化成只含核酸的类病毒;类病毒再进化成有蛋白质外壳包围着核酸的病毒;由只含一种类型核酸的病毒,进化成同时含DNA和RNA的衣原体、立克次体、     

苹果锈果类病毒的温度梯度凝胶电泳

用温度梯度凝胶电泳技术研究了苹果锈果类病毒(ASSV)的变性行为,并与菊花矮化类病毒(CSV)的变性行为进行了比较。提纯的ASSV的温度梯度电泳示出了类病毒特有的从类似于棒状的分子到打开的环状分子的构象转变曲线,与CSV及报道的马铃薯纺锤块状类病毒(PSTV)相似。但ASSV的构象转变中点温度及转变的协同性均低于CSV。在8.9mol／LTBE缓冲液中,ASSV构象转变的中点温度和半辐值分别为41．5℃和2.4℃,而CSV的分别为46.0℃和1．0℃。在ASSV的温度梯度凝胶电泳图中,除了有代表单分子构象转变的曲线外,还观察到另一构象转变曲线,作者认为这代表了在提纯过程中由分子间碱基配对形成的双分子复合体的变性曲线。     

朊病毒(侵染性蛋白质)的发现

一、引言羊瘙痒病的病原是经过近两个世纪的研究未能解决的一个谜。曾作过各种可能的解释,但都没得到证实。发现类病毒后,有人研究其类病毒病因的可能性(Diener,1979)。最近,美国加州大学旧金山分校动物病毒学家Prusiner发现羊瘙痒病是蛋白质侵染引起的疾病,并称谓“Prioa”(Protein infection的缩写)或