PCR特异产物回收纯化方法的比较

方法：采用三种方法对苹果褪绿叶斑病毒RT-PCR的特异DNA产物进行回收纯化。目的：针对不同情况,选择适宜的回收纯化方法。结果：用普通琼脂糖替代低融点琼脂糖,回收纯化后产物的浓度及纯度与低融点琼脂糖法基本一致,完全可以用普通琼脂糖替代低融点琼脂糖进行DNA片段的回收纯化,从而降低成本,简化操作。玻璃奶法的回收纯度明显高于低融点琼脂糖法和普通琼脂糖法,且更快速安全,是采用普通琼脂糖法还是采用玻璃奶法回收纯化DAN片段应以实际需要而定。     

mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较

目的：建立简化的mRNA差异显示技术中特异条带的回收方法。方法：用单个小鼠早期发育的胚胎构建mRNA差异显示技术,用一步法和煮沸法分别从银染的聚丙烯酰胺凝胶中回收差异显示的特异条带,并进行再扩增、回收、克隆及酶切鉴定。结果：两种不同的回收方法经过mRNA差异显示技术程序环节,证明其具有相同的实验效果。结论：应用简化的一步法和煮沸法对单胚构建的mRNA差异显示技术中的特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。     

一种有效回收短片段PCR产物的方法

目的:为了有效地回收小于200bp的短片段PCR产物。方法:研究了在-20℃条件下,用无水乙醇和3mol/l醋酸钠共沉淀短片段的PCR产物的方法。结果和结论:用这种共沉淀PCR产物的方法,它能够有效地回收小于200bp以下的DNA片段,并且回收到的片段能够有效的进行酶切反应和T-载体连接反应。这种方法也能够回收酶切后的短DNA片段,并对后来的连接反应没有影响。这种共沉淀回收短片段DNA方法相对于其他方法来不仅具有可行性,而且有经济和操作简单的优点。     

差异显示反转录PCR技术研究进展

分析一对细胞或组织在不同状态下基因表达的差异,已成为分子生物学研究领域的热点之一.近年来,用于识别差异表达基因的方法已发展起来多种.DDRT-PCR是近年来较为广泛应用的一种技术.理论上,DDRT-PCR技术比较简单,但实施起来却存在着假阳性率高,凝胶中单条cDNA带成分不均一, 所获cDNA仅代表着mRNA 3′UT区(约300 bp)以及一些低拷贝数mRNA不能有效被呈现等问题.对DDRT-PCR技术的改良也主要集中在解决这些问题方面.     

运用多种策略改良差异显示PCR

目的：改进差异显示PCR技术,提高其在筛选差异表达基因方面的效率。方法：①采用单碱基金铆钉引物;②增加引物长度;③提高PCR反应的严谨性;④应用同步重复测序电泳。结果：减少经典方法的工作量,降低了非特异性和假阳性率。用改良技术研究热适应大鼠下丘脑基因的差异表达,发现了一个差异表达基因片段,斑点杂交证实为阳性片段。结论：改进后的差异显示PCR技术是一种研究基因差异表达从而发现新基因或基因新功能的有效方法。     

快速捕获基因的方法——差异显示法

差异显示法是近年来出现的一些快速捕获基因的新方法,它的不断改进与完善,使基因表达的研究提高到一个新的水平。本对该方法的模板、引物、差异显示和鉴定等关键问题进行了论述。     

一种用于PCR模板制备的电泳产物简易回收方法

为了探索一种简便、有效而且能从琼脂糖凝胶中大量回收用于第2次PCR扩增的DNA电泳条带的方法,采用刀片切胶法和牙签插胶法从琼脂糖中回收DNA,并进行了两种方法的比较．结果显示牙签插胶法回收的DNA用作第2次PCR的模板,获得了清晰、稳定的PCR产物电泳条带,用该法成功地制备了一批DNA微阵列探针．由此可见牙签插胶法是一种简便、快速、有效的用于PCR模板的DNA琼脂糖凝胶回收法．     

降低mRNA差异显示技术假阳性率的一种方法

为了探讨降低mRNA差异显示技术假阳性率的方法 ,进一步提高此技术的可靠性 ,提取了手术切除肝癌及非癌肝组织成对标本的总RNA ,逆转录获得cDNA片段 ,以mRNA差异显示方法筛选差异表达基因 ,选取较明显的一条差异表达条带 ,行进一步PCR扩增 .分别对PCR产物及其经TA克隆后随机挑选的 6个单克隆质粒DNA进行序列分析 ,并通过GenBank BLAST数据库进行序列的同源性比较 ,以Northern杂交予以来源确认 .自 72 0余条扩增条带中共选出 2 8条差异条带 .序列分析及同源性比较表明 ,所选择条带的PCR产物为一可能的新基因片段 ;而随机选择的 6个TA克隆质粒DNA中 ,有 4个为同一已知基因片段 ,一个为另一已知基因片段 ,一个为一可能的新基因片段 .同源性比较表明 ,PCR产物直接测序所得序列与TA克隆质粒DNA的 6个片段不具同源性 .结果表明 ,mRNA差异显示条带可能由 1条以上分子量相似的片段构成 ,直接对PCR产物行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,是导致出现假阳性片段的原因之一 .将PCR产物进行TA克隆 ,对单克隆质粒DNA进行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,可能是解决此问题的一种较好方法 .     

一种快速mRNA差异显示技术及用于分离辐射诱导转录子

介绍一种从不同类型细胞或不同生长状态细胞中分离差异表达基因的快速ｍＲＮＡ差异显示技术．其特点是不用同位素标记,操作简便,在普通琼脂糖凝胶电泳中就能分辨差异显示的ｃＤＮＡ带,便于ＤＮＡ回收和进一步重组克隆．用此方法成功地分离到电离辐射诱导转录子．     

真核生物mRNA差显技术(Differential Display)的研究进展

真核生物ｍＲＮＡ差显技术（ＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｌＤｉｓｐｌａｙ）的创立及其对该技术的一系列改进,为研究与生殖、发育、细胞分化、癌变、病变、衰老、程序化死亡及抗逆性与抗病性等生命过程有关的基因的差异表达,以及有关基因的分子克隆提供了有效工具。本文简要概述差显技术的原理、优越性、主要缺陷、技术改进等方面的研究进展。     

mRNA差别显示技术在植物发育研究中的应用

mRNA差别显示技术是近年发展起来的研究基因表达差异的有效方法,它不仅可比较基因表达差异、追踪已知基因的表达情况,而且可作为寻找特异表达基因的重要手段。本文介绍此方法在植物春化作用、光周期反应、花发育、雄性不育、成熟、衰老、种子发育和休眠及根发育等研究领域的应用概况。     

利用mRNA差别显示技术分离盐胁迫下红树植物白骨壤耐盐相关cDNA

从福建龙海红树林自然保护区采集白骨壤的隐胎生果实 ,在实验室分别置于 0‰盐度海水和 50‰盐度海水进行沙培。分别取叶片 ,提取纯化RNA。通过锚定引物OligodT₁₂ GC反转录和 8个 10核苷酸随机引物进行PCR扩增 ,经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现了 3个差异DNA片段只在高盐培养条件的白骨壤基因组中表达 ,而在无盐培养条件中没有出现。这 3个差异cDNA片段分别命名为csrg1(600bp)、csrg2(550bp)、csrg3(480bp)。3个差异cDNA片段的RNA杂交结果显示 ,只有csrg1片段存在明显差异 高盐中有杂交斑点 ,无盐中无杂交斑点 ;而其余 2个片段在高盐和无盐条件下都没有杂交斑点出现。从而表明csrg1就是耐盐相关cDNA。进一步将csrg1片段克隆 ,并进行DNA序列分析。全序列在GenBank中查询后 ,未发现相关同源片段。耐盐相关cDNA片段的获得 ,将为分离全长耐盐基因 ,搞清该基因表达调控的机理提供条件.     

Recovering and reamplifying of the differentially expressed cDNA bands isolated from mRNA differential display

Methods for retrieving and reamplifying the differentially expressed cDNA bands have been modified. Direct reamplification of differentially expressed bands after cutting from a polyacrylamide gel (PAG) followed by a simple rinse and crush step has proved to be more convenient and effective than the traditional glycogen-precipitation method. Combination of 30 cycles of differential display (DD) polymerase chain reaction (PCR) and 20 cycles of standard PCR reaction also yielded higher reamplification rates.     

mRNA差异显示技术在动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用

动物从卵裂开始的早期胚胎发育始终伴随着ｍＲＮＡ不断的合成与降解。最初受着受精卵内母体ｍＲＮＡ的控制。当这些ｍＲＮＡ在发育过程中逐渐被降解时,有些动物（如小鼠）在比较早的时期已有新基因的转录;而有些动物（如鱼类、两栖类）迟到囊胚中期以后,合子核的基因才开始转录新的ｍＲＮＡ。ｍＲＮＡ这种有规律的代谢活动控制着细胞的分化、胚层的形成以及模式形成（ｐａｔｅｒｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。所有这些ｍＲＮＡ水平上的变化都可以用ｍＲＮＡ差异显示法（ｍＲＮＡｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ）检测出来并进而获得与早期胚胎发育有关的基因。ｍＲＮＡ差异显示法是由Ｌｉａｎｇ和Ｐａｒｄｅｅ于１９９２年建立起来的,用于显示两种不同组织之间ｍＲＮＡ差异的方法。基于绝大多数ｍＲＮＡ有一个ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴,选用一个较特殊的３’端引物─５’Ｔ１１ＭＮ３’,其中Ｍ可以是ｄＡＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ之一,而Ｎ可以是ｄＡＴＰ,ｄＴＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ之一,进行逆转录时,１／１２的ｍＲＮＡ可被逆转录为ｃＤＮＡ。这种ｃＤＮＡ第一链被用来ＰＣＲ扩增,所使用的３’端引物与逆转录引物相同,而５’端引物为１０个碱基的一段寡核苷酸,这类任意（ａｒｂｉｔｒａｒ     

mRNA差别显示研究肝再生调控基因

以正常肝和再生肝为对比材料,利用mRNA差别显示技术,研究肝再生过程中基因的差别表达,旨在从基因选择性表达水平上探讨肝再生调控机理. 得到4种未知肝再生相关cDNA,完成其克隆与序列分析,一例在再生肝中的表达低于正常肝,余者则高于正常肝. 这些序列均已在EMBL(Europe Molecular Biology Laboratory)数据库中登录,登录号分别为X95721、X95722、X95723、X97973.     

应用改良的mRNA差异展示法克隆人鼻咽上皮特异性表达的cDNA片段

本文对ｍＲＮＡ差异展示法进行了改良．利用一组随机引物与来源于ｍＲＮＡ翻译起始位点区域的引物组合进行ＲＴ－ＰＣＲ,使差异展示的片段来源于蛋白编码区,并对差异展示的条件进行了优化．应用此法对人鼻咽上皮与软腭口腔粘膜上皮的基因表达进行了比较研究,得到了１０个在鼻咽上皮特异表达的ｃＤＮＡ片段,并对其中的５个片段进行了亚克隆和序列分析．通过与ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库中的序列进行同源性比较,确定其中两个片段为未知新序列,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实其中一个片段ＮＥＳ１为鼻咽上皮特异性表达片段．     

用mRNA差异显示法分离冷胁迫香蕉幼苗叶片内水杨酸诱导表达的基因

用mRNA差异显示法对7℃低温胁迫3 d后的香蕉幼苗叶片进行研究,回收了18条在低温下水杨酸(salicylic acid,SA)诱导的差异带;反向Northern杂交证明,SA在低温胁迫下能诱导7条差异带高表达.对其中最显著表达的两条差异带(G和A)进行克隆和测序,结果显示,G片段序列与大豆在冷胁迫环境下两个高表达基因片段的部分序列有92%同源性;A片段未发现其同源性基因片段.     

利用mRNA差异显示技术分离甜菜M14品系特异表达基因的cDNA片段

二倍体栽培甜菜与白花甜菜杂交、进一步回交而获得的单体附加系M14,其染色体组成中除了含有18条栽培甜菜染色体外,还附加有一条野生白花甜菜第9号染色体,该附加染色体通过母本的传递率为96.5%;单体附加系传递率如此高的原因是因为M14中有无融合生殖基因的存在。本实验采用mRNA差异展示技术对甜菜无融合生殖品系M14和正常有性生殖的二倍体栽培甜菜A2Y花蕾减数分裂时期的基因表达进行了差异分析。采用GT15A,GT15G,GT15C3种锚定引物,共筛选了20个随机引物,通过RT-PCR检测,获得了6个阳性差异表达的cDNA片段,应用NCBI的BLASTx软件对测序结果进行同源序列、相似序列检索,为进一步克隆无融合生殖基因提供侯选cDNA片段。