胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞的分离和培养

研究采用显微解剖、无血清细胞培养和免疫荧光细胞化学染色等实验技术 ,成功地建立了胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞 (NSCs)的分离和培养方法。结果显示 ,( 1)在含成纤维细胞生长因子 2 (FGF 2 )和表皮生长因子(EGF)的无血清培养液中 ,两种来源的NSCs经体外培养 8- 10代后 ,其细胞数呈指数级增加 ,其中脑来源的NSCs数由原代培养时的 1× 10 6 增加至 1× 10 12 ,脊髓来源的NSCs数从 1× 10 6 增加至 1× 10 11。增殖的细胞表达神经上皮干细胞蛋白 (nestin) ;( 2 )在含 1%胎牛血清 (FBS)的培养条件下 ,它们都能被诱导分化为神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞。但其分化比例可随细胞传代次数的增加而改变 ,其中 ,大脑来源的NSCs分化为神经元的比例从第二代 (P2 )的 11 95± 2 5 %下降至第五代 (P5)的 1 97± 1 16% (P <0 0 1) ,而少突胶质细胞的分化比例则基本保持不变 ,这一分化格局同样可在脊髓来源的NSCs中发现。结果表明 ,我们所分离和培养的细胞在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能 ,它们都表达nestin ,属于中枢神经系统的干细胞     

酿酒酵母原生质体融合的研究

本实验通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)营养缺陷型菌株H802-9A(a ade~-his~7 cys~2 tyr~1)和H802-3 A(a ade~- cra~1)进行原生质体融合,获得营养互补的重组融合子,选择两亲株的对数生长早期细胞(2-4×10~7个/m1),在0.1％β-琉基乙醇及1-2％蜗牛酶的作用下,原生质体形成率达99-100％,在35％聚乙二醇(MW6000)-10mMCaC1溶液的作用下,可获得融合率为2.6×10~(-6)-2.1×10~(-7)的杂合子,自发回复突变率1.5-7×10~(-9)。     

减毒HAV在体外抑制HBV表达HBeAg和HBsAg的实验研究

目的　探索减毒甲型肝炎病毒( HAV) ( H2减毒株)在Hep G2 .2 .15细胞中对乙型肝炎病毒( HBV)表达HBs Ag和HBe Ag的影响。方法　在Hep G2 .2 .15细胞中,加入含3×10 - 2 ( 3×10 4 .5CCID50 / ml) ,3×10 - 3( 3×10 3.5CCID50 / ml)浓度的减毒HAV。按不同疫苗浓度,每4 d换液1次,留取第12和第16天的培养上清液;同时设立对照组。用微粒子酶免分析法检测培养上清液中的HBs Ag和HBe Ag含量。计算减毒HAV在不同浓度,以及不同作用时间长度的条件下,对Hep G2 .2 .15细胞表达HBs Ag和HBe Ag的影响。结果　3×10 - 2 Ampoule/ ml的减毒HAV作用Hep G2 .2 .5细胞12 d后,培养上清液的HBe Ag浓度为( 4 7.2 3±6 .18) S/ CO,低于对照组的( 10 1.15±15 .77) S/ CO,2组比较差异有非常显著性( P<0 .0 1) ;16 d后,上清液HBe Ag含量为( 4 0 .2 7±13.30 ) S/ CO,也显著低于对照组的( 6 5 .85±3.4 6 ) S/ CO( P<0 .0 5 ) ;HBs Ag含量为( 2 .6 8±0 .31) S/ N,低于对照组的( 5 .10±1.2 7)S/ N,差异有显著性( P<0 .0 5 )。而3×10 - 3Ampoule/ ml的减毒HAV作用Hep G2 .2 .15细胞12 d后,培养上清液的HBs Ag浓度与对照组比较有显著性下降( P<0 .0 5 )。结论　一定浓度的减毒HAV可能有直接抑制HBV表达HBs Ag,HBe Ag的作用     

沙打旺胚性原生质体培养优化及高频再生植株

外植体类型和光照条件决定沙打旺胚性愈伤组织的形成。用生长10d的胚性愈伤组织可分离到1.2×10⁶个/g(原生质体/细胞),活力超过80%。当原生质体以1.0×10⁵/mL的植板密度培养在含0.6%琼脂糖附加1.5mg/L 2,4-D、0.5mg/L BA和0.5mol/L葡萄糖的培养基(无机盐降为1/4)中,植板率为16.8%。条件培养基显著促进原生质体的生长发育。长大的细胞克隆经2周4℃低温处理后转到含0.1mg/L NAA和1.0mg/L BA分化培养基上,体细胞胚胎发生频率高达70%,每克细胞产生的体细胞胚数在200个以上。成熟的体细胞胚转到无激素的1/2MS培养基中即分化成苗,再生植株为正常的二倍体。     

新月弯孢霉原生质体的形成与11β—羟基化反应

研究了新月弯孢霉原生质体形成的条件以及 1 1 β-羟基化反应。将培养 1 6～ 1 8h的菌体 ,以0 .6mol/LKCl作为渗透压稳定剂 ,3 0℃下 ,经过 1 %溶壁酶和 1 %纤维素酶混合酶液 ( pH5.6)酶解 4～ 5h ,原生质体释放量达 6.1 1× 1 0 6/ml,再生率为 1 3 .1 %。原生质体细胞具有 1 1 β -羟基化反应的能力 ,氢化可的松转化率为 4 4.4 4%。     

实验3 RNA的分离纯化

一、哺乳类细胞总RNA的提取 1.从培养细胞中提取 (1)准备10瓶(底面积为4.5×8.5cm~2)长得半满的培养细胞(约10~7个细胞)。 (2)吸去瓶中培养液,各加入5ml新鲜培养液,37℃培养4小时左右。 (3)吸去培养液,各加入5ml预冷的1×PBS溶液     

番木瓜环斑病毒在番木瓜原生质体中复制的初步研究

以1.0％的Macerozyme R—10,1.5％的Cellulose Onozuka R—10,0.45mol/L的甘露醇和pH5.4的培养基作为分离番木瓜原生质体的最佳条件,得到了高活力和高产量的原生质体。PRV-Ys(Vb)株系和聚鸟氨酸(PLO,WW200000)分别以1μg/ml的最终浓度接种番木瓜原生质体(5×10~6原生质体/ml),成功地建立了PRV—番木瓜原生质体体系。对于PRV在番木瓜原生质体中复制的行为动态差异,本实验研究了PRV-Ys和PRV-Vb两株系,三个不同抗性梯度的番木瓜原生质以及不同培养温度之间相互作用,相互影响的关系,从而认为PRV不仅能在寄主品种Carica papaya var,F1和C.papaya var.Tw-5而且还能在非寄主C.stipulata的原生质体中进行增殖;环境温度不仅能影响PRV在番木瓜细胞中的增殖能力,而且还能影响植株细胞本身的生活能力和抗PRV侵染的能力;PRV-Ys和PRV-Vb两株系在C.papaya var.F1原生质体中的增殖潜伏期和增殖曲线没有明显差异。     

利用细胞松弛素B分离柑橘及金柑植物微核的研究

采用细胞松弛素B(CB)处理结合蔗糖梯度超速离心方法分离柑橘和金柑亚原生质体的结果表明,柑橘和金柑原生质体的直径为20～30μm,采用蔗糖梯度超速离心分离亚原生质体,其适宜离心力是1400000×g;4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的染色效果最好,细胞核和细胞质可明显区分;愈伤组织经CB处理36h后再分离亚原生质体,可显著提高微原生质体的产量,分离的微原生质体直径为1.8～3.5μm,产量达到2～3×104个·g-1(FW)。     

姬菇原生质体制备与再生条件初探

目的探索姬菇(Pleurotus cornucopiae)菌丝原生质体制备和再生条件.方法以培养5d的幼嫩菌丝体为材料,在1.5%溶壁酶 0.5%纤维素酶混合酶作用下,以0.6mol/L甘露醇作渗透压稳定剂于pH5.5,30℃酶解2.5h,然后用血球计数板计数,计算原生质体产量.结果在上述条件下,原生质体产量达到3.12×107个/mL.原生质体适宜的再生培养基为马铃薯200g,蔗糖20g,酵母膏2g,KH2PO4 3.0g,MgSO4 ·7H2O 1.5g,维生素B1 0.1g,0.6mol/L甘露醇.采用上述培养基,原生质体再生率达到O.78%.为姬菇原生质体诱变及融合育种奠定了基础.     

广藿香原生质体制备、培养与融合技术优化研究

为建立高效稳定的广藿香原生质体培养与融合技术体系,该研究以广藿香愈伤组织悬浮细胞为材料,研究了原生质体制备的酶解条件和培养方法、细胞密度、激素种类和浓度等因素对原生质体培养的影响,并通过测定融合产物直径确立融合细胞筛选范围,进一步研究聚乙二醇浓度、细胞密度、融合时间及融合液加入量等因素对原生质体融合的影响。结果表明:制备原生质体的适宜条件为pH5.8,酶解温度25 ℃; 原生质体培养以铵盐减半的MS₁培养基进行海藻酸钠包埋、激素选用0.2 mg·L^-1 NAA、2.0 mg·L^-1 6-BA,培养密度2.0×10⁵个·mL^-1、蔗糖添加量1.0%、酸水解酪蛋白500 mg·L^-1的条件下原生质体分裂频率、植板率均较高,且开始分裂时间和细胞团形成时间都较短; 双细胞融合产物筛选范围为69.33～87.35 μm; 以40% PEG 6000化学促融30 min、加入0.5倍体积的融合液、细胞密度2.0×10⁵个·mL^-1的条件进行原生质体融合,聚合率可达57.19%; 获得的融合产物经海藻酸钠包埋培育2个月后可观察到再生愈伤组织。     

人体细胞漫谈

人体细胞的数目人和所有行有性生殖的生物一样,都是由一个细胞——受精卵发育而来的.据推算,刚出生的婴儿全身约有二十万亿(2×10~(18))个细胞.经过二十多年的分裂生长,成人体内细胞约为三百万亿(3×10~(14))个. 据估算,人体神经系统内含有10~(11)个神经细胞(又叫神经元),仅大脑皮层就约含140亿个神经细胞.如果以成人体内血量平均为4.5升计算,成年男性体内红细胞约为2.25×10~(10)个(500万个/mm~3×4.5×10~3);女性体内红细胞约1.89×10~(10)个(420万个/mm~3×4.5×10~3;白细胞2.25×10~7～4.5×10~7个;血小板约为4.5×10~8～1.35×10~9个.     

苗龄与红光对向日葵原生质体分离和培养的影响

用1.0—1.5%(W/V)纤维素酶(Onozuka R-10)和0.3—0.5%(W/V)果胶酶[Pectinasc (Serva)]配合分离到大量有活力的向日葵下胚轴原生质体,经液体浅层培养或琼脂糖小块培养7—10天后,均能持续分裂到细胞团或体细胞胚,至14—21天形成大量肉眼可见的小愈伤组织(直径0.5—2.0mm)。比较试验表明:(1)影响向日葵下胚轴原生质体分裂生长的首要因素是起始材料无菌苗的生理状态。用红光照射无菌苗,能明显地促使下胚轴原生质体在较低密度(1×10~4/ml)培养时,也能持续分裂,再生小愈伤组织;(2)在MS培养基上添加5mmol/L谷氨酰胺或以7.5mmol/L谷氨酰胺代替原培养基中的无机氮,能促使原生质体高频率(44.4%左右)分裂,再生愈伤组织。     

亚麻原生质体培养及植株再生

试验分别采用四个纤维用亚麻(Linumusitatissimum)品种7309,948,Belinka和Viking的无菌苗的茎尖为材料游离原生质体。以萌发10天的无菌苗茎尖游离获得的原生质体得率和活性最高,分别达到1．8×106／gFW和85．5％。以V-KM为培养基,采用琼脂岛法培养的原生质体,可在培养3天后发生第一次分裂,10天后统计细胞分裂频率为36％,20天后统计植板率达到5．2％。品种7309和Belinka再生的愈伤组织接种在均附加o．6mg/L6-BA和0．1mg／LNAA的B5-1和MS3固体培养基上,都有芽苗分化,并分别获得再生植株。品种Viking和948分别仅分化获得了不定根或叶状体。     

草菇(Volvariella volvacea)、银丝草菇(V.bombycina)原生质体分离研究

本文对草菇、银丝草菇菌丝原生质体制备的最佳条件作了探讨。结果表明,培养两天的草菇菌丝,以0.5MKCI或0.5MMgSO_(4.7)H_2O作渗透压稳定剂,1.5％Lywallzyme(v/m),35℃下酶解1.5—2小时,原生质体产量可达1.5×10~6个/ml以上,培养3天的银丝草菇菌丝,以0.5MKCl作渗透压稳定剂,1.5％Lywallzyme,28℃酶解2—3小时,原生质体产量可达2.8×10~6个/ml以上。此研究对以后的原生质体融合育种打下了基础。     

谷子原生质体的分离和培养(简报)

取继代培养后4—5天的谷子(Setariaitalica,品种豫谷一号)悬浮培养细胞,用含2%纤维素酶(Onozuka Rs)和0.1%果胶酶(Pectolyase Y 23)的酶溶液酶解分离原生质体。原生质体纯化后的产量在2—6×10~6原生质体/克鲜重。原生质体在培养2天后形成细胞壁并开始进行分裂。在培养6天时的分裂频率达5—12%。此后随添加新鲜培养基并降低培养基的渗透压,形成细胞团。培养一个月后,可将可见的细胞团转移到附加2,4-D和激动素的MS琼脂培养基上,即形成旺盛生长的愈伤组织。     

甘蓝下胚轴原生质体再生植株

经纯化后,甘蓝下胚轴原生质体的产量为1．5×10⁶g^-1(Fw),采用液体浅层培养的方法进行培养。2～3d后,发生第一次分裂,第10天,统计分裂频率为6l％,5周内形成大量的细胞团和小愈伤组织,统计植板率为1．1％,把小愈伤组织转到与原生质体培养基相同激素的MS固体培养基上增殖。当愈伤组织长到3～5mm大小时,接到分化培养基上,芽分化率为46.7％．分化出来的芽长到3～4cm长时,从基部切下,插入生根培养基,两星期左右即可长成完整植株。     

黑果枸杞原生质体培养及植株再生

该研究以黑果枸杞(Lycium ruthenicum)无菌苗为材料,建立了愈伤组织来源的原生质体再生体系,采用ISSR和FCM技术对再生植株进行了遗传稳定性分析。结果表明：(1)黑果枸杞叶片愈伤组织是产生原生质体的最好材料,在含0.5 mg·mL^-1甘露醇的酶液中,继代1次的叶片愈伤组织中原生质体产量为7.77×10⁶个·g^-1,活力为92%。(2)改良MS培养基 固体液体双层培养(MS₂ 固液双层)是培养原生质体的最好方式,培养10 d的原生质体分裂频率为45.9%,培养20 d的细胞团形成频率为22.9%。(3)在1.5 mg·mL^-1 6 BA+0.1 mg·mL^-1 IBA+MS培养基中,叶片愈伤组织产生的原生质体可分化获得再生植株。(4)ISSR分析显示,再生植株的平均遗传相似系数为0.88;FCM显示再生植株为二倍体,与亲本植株一致。该研究结果为进一步研究枸杞体细胞杂交技术转移野生植物抗逆遗传性状提供科学依据,为枸杞优良品种的选育奠定了基础。     

细胞工程

植物细胞、组织及原生质体培养951258大麻槿的原生质体分离和培养[会,英]/Liu,D.…/Horts cience.一1994,29(7).一729[译伯DBA,1994,13(20),94-117182 由6种大麻槿栽培种开发了原生质体分离和培养方法。对于原生质体分离,水解酶最佳组合是用Cellulysin(1%w/v)和Macerase(1.5%w/v)在30℃、黑暗下消化24zb时。产量达到7.2 X 10。原生质俸/g叶组织。原生质体存活数为65"-'96%。不同的栽培种间原生质体产量略有不同,但生活力均在许可范围内。最初以10e原生质体/ml的密度培养于液体培养基中时,细胞分裂频率和植板率最高。开发了电融合法,以此…     

介绍一种渗透装置的制作和使用

具有成熟液泡植物细胞 ,失水或吸水是通过渗透作用实现的。利用本文介绍的渗透装置进行渗透作用演示实验 ,可以显著提高实验的效果 ,这对学生深刻理解渗透作用原理具有较好的帮助。1　装置的制作1 .1　材料用具　 6ｃｍ× 4 0ｃｍ大小的无色透明的有机玻璃薄板 (或无色透明的录音磁带盒 ) ,直径 1 .5ｍｍ2ｍｍ、长 2 5ｃｍ无色透明的玻璃管或塑料管 ,直径 6ｍｍ的玻管 ,细齿锯条 ,砂皮纸 ,有机溶剂氯仿 ,防漏玻璃胶 ,尺 ,酒精灯 ,解剖器 ,橡皮塞 ,脱脂棉 ,小扁锉 ,半透膜等。1 .2　装置的制作过程1 )用细锯条将有机玻璃板截出 6ｃｍ× 6ｃｍ…     

芽孢杆菌原生质体的形成和质粒转化的研究

测定了芽孢杆菌属中21个种、68个菌株的原生质体形成率。在高渗缓冲液(SMMP 或SMN)中,原生质体形成率在90％以上的有37株。降低高渗缓冲液中钠离子浓度,有利于原生质体的形成。用质粒(pUB 110或pC194) DNA对16株芽孢杆菌的原生质体进行了转化试验。转化成功的共8株：纳豆芽孢杆菌AS 1.107、AS 1.921、幼虫芽孢杆菌AS 1．430、球芽孢杆菌AS 1.1362、迟缓芽孢杆菌#50、苏云金芽孢杆菌松蠋亚种AS 1．294、地衣芽孢杆菌# 18和坚强芽孢杆菌#28。原生质体在DM3再生培养基上的再生率分别为0．1％一19．2％,转化效率分别为1．4×102一1．0×105转化子／μgDNA。转化效率低或未转化成功的菌株,其原生质体的再生率一般都很低或不能再生,有的菌株在形成原生质体后发生自溶。