构巢曲霉内切纤维素酶A10在毕赤酵母中的表达及重组蛋白质的表征

内切纤维素酶是纤维素酶高效降解纤维素的一个关键因子,已广泛应用于工业生物技术领域。对来源于腐生真菌构巢曲霉的一个内切纤维素酶进行过表达及详细的酶学性质研究,研究结果表明:该内切纤维素酶在摇瓶和发酵罐条件下都成功获得表达,发酵罐条件下的蛋白质表达量达到0.89 mg/mL;该酶的最适反应p H和温度分别为4.0和80℃,在pH 2.0–12.0之间表现出了很好的稳定性;在温度￡60℃时,该酶非常稳定,当温度370℃,酶的稳定性大大降低;Co~(2+)、Mn~(2+)和Fe~(2+)促进了CMCase活性,而Pb~(2+)、Ni~(2+)和Cu~(2+)等金属离子表现出了一定的抑制作用。因此,该构巢曲霉内切纤维素酶表现出了非常好的耐酸、耐碱以及一定的耐热性等性能,具有开发为商品酶的潜力,为深入开发构巢曲霉来源糖苷酶的应用奠定了基础。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

黑曲霉嗜热β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的克隆表达及其魔芋降解产物分析

根据毕赤酵母密码子偏好性优化设计合成一段来自黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶基因,通过构建表达载体pPICZαA-man线性化后电转化入不同的毕赤酵母宿主,获得最佳重组菌KM71-MAN,其发酵罐发酵酶活最高达2 318.85 IU/mL。表达产物纯化后的分子量约为40 kD,最适反应温度为80℃,最适pH为5.0。该酶在70℃(pH5.0)保温44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范围内保温70 h(50℃)酶活力仍能保留85%以上。利用发酵罐所产重组酶酶解魔芋胶制备甘露低聚糖,产物以甘露二糖和甘露六糖为主,甘露低聚糖得率为55.6%。该重组β-甘露聚糖酶具有良好的热稳定性和pH稳定性,在魔芋制备甘露低聚糖中具有较好的应用潜能。     

枯草芽孢杆菌中性内切β-甘露聚糖酶的纯化及性质

三草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ９６０２产生的中性内切β－甘露聚糖酶（ｅｎｄｏ－β－１,４－Ｄ－ｍａｎｎａｎ ｍａｎｎａｎｏｈｙｄｒｏｌａｅｓ,ＥＣ,３．２．１．７８）经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－纤维素（ＤＥ２２）离子交换柱层析,得到电泳纯的样品,提纯了４５．５倍,收率为５．９％。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得该酶的分子量为３５ｋＤ。用ＰＡＧＥＩＥＦ测得其等电点ｐⅠ为４．５。酶反应的     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。     

木聚糖酶和甘露聚糖酶在毕赤酵母中的共表达及产酶分析

木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种重要的半纤维素酶,也是两种重要的饲用酶制剂,通过毕赤酵母表达系统中的体外串联表达盒构建多拷贝的方法构建了木聚糖酶DSB和甘露聚糖酶Man A共表达重组质粒p PICZαA/DSB-ManA,将该重组质粒电转化至宿主菌毕赤酵母X33中获得共表达两种酶的重组菌X33/DSB-ManA,实现了两种酶的共分泌表达,经诱导表达后木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活分别为273. 6 U/ml和256. 8 U/ml,为单独表达重组菌X33/DSB和X33/Man A酶活的30. 4%和73. 4%。酶学性质的分析显示DSB和Man A的最适反应温度均为75℃,在45℃～75℃范围内具有较好的温度稳定性,酶活可保持最高酶活的60%以上; DSB最适pH为6. 5,Man A最适pH为6. 0,在pH 3. 0、40℃条件下,Man A处理1h能保持最高酶活的80%以上,DSB处理1 h时能保持最高酶活的50%以上; DSB和Man A对多种金属离子和化学试剂(浓度为1 mM)具有较好的耐受性,均可保留60%以上的酶活力。通过单一菌株成功完成了不同酶的共表达,为复合酶饲料添加剂的生产和应用研究提供了一定的理论依据。     

假密环菌Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GSIl5中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47).该酶的全长cDNA共1481 bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员.诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL,蛋白含量为440 mg/L.重组酶的最适反应温度为60℃.在30℃～65℃比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定.这是首次关于Armillariella.tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料,食品、药物生产等方面有广泛的应用.     

产β-甘露聚糖酶内生菌

植物内生菌研究已经成为微生物研究的热点[1],最初主要集中于拮抗菌的筛选,近几年更关注于生物活性物质的分离.最近有报道,将从植物内生菌作为一种开发工业用酶资源的新角度去研究[2],这为继续开发其它工业用酶或生物活性物质的内生菌的研究提供了理论依据,从而拓宽了植物内生菌的应用研究范围.     

甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU /mL,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选及酶学特性分析

采用富集培养的方法从黄豆种子中分离出17株内生菌菌株, 利用刚果红染色法筛选出3株产β-甘露聚糖酶的内生菌。摇瓶培养并分别测定其酶活力, 其中一株酶活力较高, 达54.59 U/mL。经生理生化性质测定及16S rDNA序列分析, 鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。酶学性质分析发现, 该酶最适作用温度和pH分别为30 °C?50 °C和7.0, 在50 °C保温2 h酶活仍保留68%, pH 5.0?9.0条件下保温1 h酶活仍保留64%以上; Zn2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、K+对该酶有激活作用, 其中以Ca2+的激活作用最为明显, 使酶活提高了31%, Mn2+和EDTA对该酶有抑制作用。     

RT-PCR检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数

利用荧光定量PCR方法检测毕赤酵母外源β-甘露聚糖酶基因(man)拷贝数。以毕赤酵母中高度保守基因三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gap)为内参基因,分别构建含有gap和man的克隆质粒,进行RT-PCR反应构建gap和man双标准曲线;获得的双标准曲线具有良好的重复性,其相关系数(R2)均为0.999,其扩增效率分别为105.1%和102.2%。提取含有外源man基因的毕赤酵母基因组进行RT-PCR检测,通过双标准曲线计算出外源man基因的拷贝数。结果显示:预先经过博莱霉素(Zeoicn)抗性筛选得到的10株毕赤酵母重组菌株中含有1、2、3、4、5和7个不等拷贝的β-甘露聚糖酶基因。结果表明该方法能够高效快速筛选和鉴定出含有不同外源β-甘露聚糖酶基因拷贝数的毕赤酵母重组菌株。     

芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达

从新疆极端干燥环境土壤样品中筛选到具有高β-甘露聚糖酶活性的芽孢杆菌(Bacillus sp.MX).运用PCR技术从该菌基因组中克隆得到β-甘露聚糖酶基因,连接到表达载体pET-28a上.在大肠杆菌BL21中高效表达的基因产物经亲和层析纯化,SDS-PAGE凝胶电泳分析显示该蛋白的相对分子质量为41 kD.酶学性质分析表明该酶在25～95℃,pH3.0～9.6范围内均具有酶活.最适作用温度55℃和pH值5.0,酶比活力为4 572 U/mg.在最适pH 5.0,高温85℃和95℃分别处理10min后,该酶相对酶活力仍保持51%和34%,显示β-甘露聚糖酶具有较好的耐酸性和热稳定性.     

一种耐热偏酸性β-甘露聚糖酶基因克隆与高效表达

【目的】克隆半纤维素降解高效菌株Bacillus subtilis BE-91的甘露聚糖酶基因并进行原核表达,对表达产物进行酶学性质研究。【方法】采用PCR扩增法从B. subtilis BE-91菌株中克隆β-甘露聚糖酶基因,分别连接到pEASY-E1和pET28a载体,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。用DNS法对工程菌株的胞内和胞外β-甘露聚糖酶进行定量分析,选取胞外甘露聚糖酶活力高的组分进行酶学性质研究。【结果】从B. subtilis BE-91菌株中克隆的β-甘露聚糖酶基因(GenBank登录号：KP277209)在E. coli中获得高效表达,工程菌株pEASY-man/BL产胞外β-甘露聚糖酶的活性可达229.1 IU/mL;该基因序列全长960 bp,包含319个氨基酸的编码序列和一个终止密码子;表达产物的最适反应温度为65 °C,最适反应pH为6.0,属于耐热偏酸性β-甘露聚糖酶;该酶稳定温度≤65 °C,稳定pH为4.5?7.0;1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+对该酶有激活作用,而Ba2+和Pb2+有强烈抑制作用。【结论】B. subtilis BE-91拥有珍贵的β-甘露聚糖酶基因资源,其胞外表达产物的耐热偏酸性酶学性质在开发饲料添加剂方面具有潜在的应用前景。     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶atMAN47的纯化及酶学性质分析

以魔芋精粉为唯一碳源, 对假蜜环菌(Armillariella tabescens) EJLY2098进行培养, 诱导其产生β-甘露聚糖酶。经DEAE－阴离子交换层析后, 分离纯化出β-甘露聚糖酶atMAN47。酶学性质分析: 该酶分子量约为47 kD, 酶的最适反应温度为50°C, 在pH 5.0~6.5之间该酶的稳定性较好; Na+ 和Ba2+ 对该酶有激活作用, 用TLC对酶产物分析, 表明该酶为内切β-甘露聚糖酶。该酶为偏酸性的内切甘露聚糖酶, 适合发展为饲料的酶制剂, 具有良好的应用前景。     

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GS115中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47)。该酶的全长cDNA共1481bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员。诱导培养72h时重组酶活可达到1.067U/mL,蛋白含量为440mg/L。重组酶的最适反应温度为60°C,在30°C～65°C比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定。这是首次关于Armillariella. tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料、食品、药物生产等方面有广泛的应用。     

碱性β-甘露聚糖酶发酵工艺的研究

本文报道碱性β-甘露聚糖酶16L罐的发酵工艺。在发酵过程中,通气量影响菌体生长,最适通气量为1:0.75—1:1.0vvm。搅拌速度影响菌体产酶,最适搅拌速度为500r/min。碳源为魔芋粉,其适宜浓度为2%。发酵周期为40小时。发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活力达300u/ml,比摇床上培养提高了2倍。     

β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因在大肠杆菌中共表达

【目的】β-甘露聚糖酶和木聚糖酶都属于半纤维素酶,它们已经同时运用于工农业生产的许多领域。构建β-甘露聚糖酶和木聚糖酶共表达菌株并进行相关评价。【方法】通过设计一个共同的酶切位点,将菌株Bacillus subtilis BE-91中的β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因串联到表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌构建了一株能够共表达β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的菌株B.pET28a-man-xyl。【结果】菌株诱导21 h后,发酵液中β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活分别为713.34 U/mL和1455.83 U/mL,是胞内酶活的11.8倍和2.53倍。【结论】SDS-PAGE分析、水解圈活性检测和胞外酶与胞内酶酶活检测表明:两个酶均以功能蛋白独立分泌到胞外。此外,与β-甘露聚糖酶和木聚糖酶单独酶解半纤维素相比,复合酶的酶解效果更好。菌株的成功构建为复合酶制剂(半纤维素酶制剂)的研究和生产奠定基础。