热胁迫对双孢蘑菇抗氧化酶及热激蛋白基因的差异表达的影响

抗氧化酶和热激蛋白是双孢蘑菇Agaricus bisporus抵御逆境胁迫的重要蛋白,高温胁迫下菌丝会通过二者基因的差异表达来减少对自身的损伤.通过对双孢蘑菇菌丝进行40℃热胁迫处理0-120min后发现,随着热胁迫时间延长,菌丝生长速度降低、气生菌丝增多和菌丝分叉明显.转录组分析抗氧化酶和热激蛋白基因差异表达发现,在...     

植酸酶基因在家蚕－杆状病毒表达系统中的表达及其酶学特性

将从黑曲霉菌株Aspergillus niger 963克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫－杆状病毒表达系统中表达,SDSPAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到1.43 g/L血淋巴液和1.90 g/L血淋巴液。酶活性测定结果表明,在蚕体和蛹的表达活性分别为4.67×10⁸u/L血淋巴液和5.99×10⁸u/L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为50～60 ℃,最适pH值为5.5～5.0和2.5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性,可以用于生产饲用植酸酶。     

米曲霉酸性蛋白酶基因在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质

酸性蛋白酶作为一类重要的天冬氨酸蛋白酶,被广泛应用于食品、医药和皮革等领域。为推动酸性蛋白酶的研究及应用,通过对发酵豆制品样品进行宏基因组测序,从中获得米曲霉酸性蛋白酶基因pepA,在毕赤酵母GS115中进行异源表达,并对重组酶PepA进行酶学性质分析。结果显示毕赤酵母发酵上清液中酸性蛋白酶的活性为50.62 U/mL。SDS-PAGE验证PepA的分子量约为50 kDa,且发酵上清液几乎无杂蛋白。PepA的最适pH值为4.5,最适温度为50℃,Mn~(2+)和Cu~(2+)对其具有激活作用,而Fe~(3+)、Fe~(2+)与Ca~(2+)则具有抑制作用。上述研究结果可为米曲霉酸性蛋白酶的异源表达及其相关工业应用提供指导。     

植酸酶基因在家蚕—杆状病毒表达系统中的表达及其酶学特性

将从黑曲霉菌株Aspergillusniger 96 3克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫 -杆状病毒表达系统中表达 ,SDS PAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到 1.4 3g L血淋巴液和 1.90g L血淋巴液。酶活性测定结果表明 ,在蚕体和蛹的表达活性分别为 4 .6 7× 10 8u L血淋巴液和 5 .99× 10 8u L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为 5 0～6 0℃ ,最适pH值为 5 .5～ 5 .0和 2 .5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性 ,可以用于生产饲用植酸酶。     

嗜热细菌Clostridium thermocellum阿魏酸酯酶基因的克隆、异源表达及酶学特性分析

【目的】阐明嗜热细菌Clostridium thermocellum Xyn Z蛋白的阿魏酸酯酶催化域的酶学特性,为其在生物质能源及其它发酵工业中的应用奠定基础。【方法】分别构建了C.thermocellum Xyn Z的阿魏酸酯酶催化域(FAE)及该阿魏酸酯酶催化域和碳水化合物结合域(FAE-CBM6)编码基因的原核表达载体,并在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中异源表达,在此基础上分析比较了温度、pH、底物、金属离子及CBM6结合域对阿魏酸酯酶活性的影响。【结果】重组FAE酶及FAE-CBM6酶发挥催化活性的适宜pH值为5.0-9.0,适宜温度为50-70°C,它们对不同金属离子的响应有差异。【结论】在同一反应条件下,FAE-CBM6酶的酶活均比FAE高,说明CBM6结合域的存在对于阿魏酸酯酶活性有促进作用。     

双孢蘑菇优质高产栽培技术

我们于1994年引进台湾双抱蘑菇菌种及相关的栽培技术,结合本地区的具体情况,经过大面积栽培试验,生物转化率为35％左右,最高可达50％,现将此技术介绍如下：1栽培料的质量要求稻草：新鲜并且干燥,水分含量18％以下。硫酸按：白色结晶,含氮量21％。尿素：白色结晶,含氮量46％。过磷酸钙：黄褐色或灰色粉末,PZq含量15％。轻质碳酸钙：白色至灰色粉末,op含量95％以上,pH7．0～8．so熟石灰：白色粉末,pH11Lll。大米糠：黄白色粉末,无酸臭味,且不得结决。2菇房结构和栽培床的搭建①菇房结构：利用空闲民房作菇房,也可建成大棚式…     

双孢蘑菇‘双孢106’的选育报告

‘双孢106’是‘A20’通过单孢选育的品种。子实体散生,少量丛生,近半球形。菌盖白色,表面光洁,直径3.5-5.0cm,厚2.0-3.0cm,质地致密;菌柄白色,粗短,近圆柱形,基部略膨大,长2.0-2.8cm。发菌适温22-25℃,子实体生长发育温度10-24℃,最适温度16-18℃。鲜菇粗纤维含量1.00%,蛋白质含量3.54%,氨基酸总量2.84%。该品种出菇早,子实体圆整、结实,产量高,商品化等级高。适宜双孢蘑菇工厂化设施栽培。     

蜜蜂NADPH-细胞色素P450还原酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学特性分析

10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）是蜂王浆中的主要脂肪酸成分,具有抗菌、抗癌、延缓衰老等多种生理活性,但目前关于10-HDA生物合成的分子机制还不清楚。通过克隆蜜蜂NADPH-细胞色素P450还原酶（EC 1.6.2.4,NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR）,在大肠杆菌中异源表达,并对其酶学特性进行分析。结果表明重组菌经IPTG诱导后表达蛋白的分子量与预期一致,为86.29 kDa,Ni-NTA亲和纯化后测得其比活性为77.33（EU of CPR）/μg。酶学性质分析结果表明蜜蜂CPR酶最适温度与pH分别为40℃和8.0,并对一些金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性。其对底物细胞色素C的动力学参数K_m和k_cat分别为76 μM和268/min。以上研究为探究CPR在10-HDA生物合成途径中的功能奠定理论基础。     

菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达及乙醇发酵

以乙醇耐受力较强的酿酒酵母为受体菌,构建了能够分泌菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。首先,以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus中的基因组DNA为模板,PCR扩增菊粉酶编码基因inu,分别使用菊粉酶自身启动子和酵母磷酸甘油激酶 (Phosphoglycerate kinase,pgk) 启动子,构建重组表达质粒HO/p-inu和HO/pgk-inu。经NotⅠ线性化后,采用电击法转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6525,分别得到含菊     

谷氨酸棒杆菌过氧化氢酶的异源表达、纯化以及酶学性质

过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧气,在工业上有着较为广泛的应用。然而,纺织和造纸工业的特殊的高碱性环境,使得开发碱性过氧化氢酶有着重要的应用价值。利用大肠杆菌表达来自于谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶,对其表达条件进行了优化,并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化重组蛋白,然后表征纯酶的酶学性质。最适表达条件为:诱导剂IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间11 h。过氧化氢酶比酶活达到55 266 U/mg,具有较高的催化活性。该酶具有相当宽泛的p H值适应范围,在p H 4.0–11.5范围内均具有较高的酶活性,并在p H 11.0条件下表现出最高的酶活性。将纯酶在p H 11.0的溶液中处理3 h时剩余酶活为93%,说明该酶在高碱条件下有良好的稳定性。该酶最适温度为30℃,在25–50℃热稳定性较好。其动力学参数Km为25.89mmol/L,Vmax为185.18mmol/(min?mg)。抑制剂十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、Na N3、β-巯基乙醇、EDTA对酶活有不同程度的抑制作用。来源于谷氨酸棒杆菌的过氧化氢酶具有较高的催化效率、良好的碱耐受性,在工业生产中有较好...     

酿酒酵母表达和纯化功能性的铁载体合成蛋白PchE

【目的】利用酿酒酵母表达系统,通过乙醇脱氢酶启动子异源表达细菌源的铁载体合成蛋白PchE,并与来源于枯草芽孢杆菌的泛酰化酶Sfp同宿主共表达,探索真核表达体系表达具有生化活性的细菌源蛋白。【方法】从大肠杆菌BAP1染色体上扩增sfp基因,将pchE基因及串联的pchE与sfp基因分别构建到酵母-大肠杆菌穿梭质粒pXW55中,各自转化酿酒酵母BJ5464-npg A表达,经过亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,利用HPLC检测细菌源与酵母源表达的PchE在体外重构生化反应中的催化活性。【结果】利用酿酒酵母表达系统可以获得高纯度的原核蛋白PchE。真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰PchE,合成中间产物HPT-Cys。【结论】在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BJ5464-npgA表达系统中,首次证明真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰细菌源的非核糖体肽合酶。比较酵母和细菌宿主的目标蛋白表达,证明酵母表达的巨大蛋白PchE的纯度更高,非特异性条带减少,推测酵母宿主可能更适合表达纯化功能性的巨型蛋白质。     

Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae

Because of many advantages, the yeast Saccharomyces cerevisiae is increasingly being employed for expression of recombinant proteins. Usually, hybrid plasmids (shuttle vectors) are employed as carriers to introduce the foreign DNA into the yeast host. Unfortunately, the transformed host often suffers from some kind of instability, tending to lose or alter the foreign plasmid. Construction of stable plasmids, and maintenance of stable expression during extended culture, are some of the major challenges facing commercial production of recombinant proteins. This review examines the factors that affect plasmid stability at the gene, cell, and engineering levels. Strategies for overcoming plasmid loss, and the models for predicting plasmid instability, are discussed. The focus is on S. cerevisiae, but where relevant, examples from the better studied Escherichia coli system are discussed. Compared to free suspension culture, immobilization of cells is particularly effective in improving plasmid retention, hence, immobilized systems are examined in some detail. Immobilized cell systems combine high cell concentrations with enhanced productivity of the recombinant product, thereby offering a potentially attractive production method, particularly when nonselective media are used. Understanding of the stabilizing mechanisms is a prerequisite to any substantial commercial exploitation and improvement of immobilized cell systems.     

酵母Sirtuins在细胞寿命中的作用

酿酒酵母(以下简略为酵母)作为寿命分析模型广泛应用于寿命研究领域。酵母寿命分析方法有两种,分别是复制型酵母寿命分析法和时序型酵母寿命分析法。目前,通过酵母寿命分析模型已识别出包括SIR2在内的多个寿命调节基因。SIR2是目前较好的被确立起来的寿命调节基因,具有NAD依赖型脱乙酰化酶的活性,从原核生物到真核生物都有良好的保守性。Sirtuins (Sir2蛋白家族的总称)在细胞内具有功能上的多样性,其中包括对于压力耐受的调节、基因转录的调节、代谢通路的调节以及寿命调节作用等。Sir2是Sirtuins家族最早发现的成员,其功能是参与异染色质结构域转录的沉默调节,同时还参与复制型酵母寿命的调节。已证明,SIR2的缺失会缩短酵母的寿命,基因表达的增高会延长寿命。Sir2的高等真核生物的同源蛋白也被证实参与衰老相关疾病的调节。本文中,我们将阐述Sir2以及Sir2的酵母同源蛋白Hst1-Hst4的功能,以及由它们调节的酵母寿命。     

Crabtree-negative characteristics of recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae

For recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae, ethanol yield and productivity is substantially lower on xylose than on glucose. In contrast to glucose, xylose is a novel substrate for S. cerevisiae and it is not known how this substrate is recognized on a molecular level. Failure to activate appropriate genes during xylose-utilization has the potential to result in sub-optimal metabolism and decreased substrate uptake. Certain differences in fermentative performance between the two substrates have thus been ascribed to variations in regulatory response. In this study differences in substrate utilization of glucose and xylose was analyzed in the recombinant S. cerevisiae strain TMB3400. Continuous cultures were performed with glucose and xylose under carbon- and nitrogen-limited conditions. Whereas biomass yield and substrate uptake rate were similar during carbon-limited conditions, the metabolic profile was highly substrate dependent under nitrogen-limited conditions. While glycerol production occurred in both cases, ethanol production was only observed for glucose cultures. Addition of acetate and 2-deoxyglucose pulses to a xylose-limited culture was able to stimulate transient overflow metabolism and ethanol production. Application of glucose pulses enhanced xylose uptake rate under restricted co-substrate concentrations. Results are discussed in relation to regulation of sugar metabolism in Crabtree-positive and -negative yeast.     

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为"最具价值的生物炼制产品之一".以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因...     

酿酒酵母SRP40基因对细胞耐受性影响的研究

【目的】本论文研究酿酒酵母srp40³⁹突变基因对酵母细胞异丁醇耐受性的影响。【方法】首先,以酿酒酵母野生型W303-1A和突变株EMS39染色体DNA为模板克隆野生型SRP40基因和srp40³⁹突变基因;然后,将野生型SRP40基因和srp40³⁹突变基因分别连接到质粒YCplac22上,构建质粒YCplac22-SRP40和YCplac22-srp40³⁹。将质粒YCplac22-SRP40、YCplac22-srp40³⁹以及YCplac22空质粒分别转化入野生型酿酒酵母W303-1A中,分别得到W303-1A-SRP40工程菌、W303-1A-srp40³⁹工程菌和W303-1A-control工程菌。将3株工程菌分别置于含1.0%异丁醇、1.3%异丁醇、8.0%乙醇和0.5%异戊醇的CM培养基中进行发酵,测定细胞密度(OD₆₀₀)和生长情况,并计算2–10 h的比生长速率（μ）。将3株工程菌于55°C热激4 min后做稀释...     

不同酿酒酵母菌株来源异麦芽糖酶IMA1的克隆、表达及表征

[目的]异麦芽糖酶IMA1在充分利用含有α-1,6-O-糖苷键的低聚糖中起着关键作用。[方法]在本研究中,对来自4株酿酒酵母菌株（包括3株嗜酸性菌株）来源的异麦芽糖酶IMA1进行克隆、表达、纯化和表征。[结果]研究发现,4种异麦芽糖酶IMA1表现出类似的pH和温度依赖性,但表现出不同的动力学参数和热稳定性。IMA1-A对α-MG（α-甲基葡糖苷）表现出最高的结合亲和力、转换数、催化效率和热稳定性。结构和序列分析表明,2个远离活性位点和底物结合位点的氨基酸的差异对异麦芽糖酶IMA1的动力学参数和热稳定性有重要影响。[结论]本研究结果对进一步研究异麦芽糖酶IMA1的结构-功能关系奠定了基础。