波形纤维蛋白与Nup 180的体外结合

本文作者采用大肠杆菌表达的波形纤维蛋白与大鼠肝细胞分离的核孔蛋白进行体外结合实验,以分析波形纤维与核孔的关系。实验结果显示,细菌表达的波形纤维蛋白在体外能组装成10 nm纤维,在体外反应体系中加入核孔蛋白后,室温反应30 min,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹法检测,结果表明180 kD核孔蛋白(Nup 180)与波形纤维蛋白有亲和反应。结合免疫胶体金标记与电镜负染色方法显示,核孔蛋白结合于体外装配的10 nm波形纤维上。本文结果提示在细胞内波形纤维可能通过与Nup 180的结合锚定于核孔复合体上。     

免疫胶体金标记显示波形纤维与核孔复合体的结合

中间纤维与细胞核的关系是一个亟待解决的重要问题。本文采用火鸡红细胞作为研究材料,首先用细胞分级抽提结合免疫印迹反应显示火鸡红细胞中间纤维蛋白为波形纤维蛋白。然后,我们采用细胞分级抽提结合包埋前免疫胶体金标记的方法显示胞质中间纤维被抗波形纤维蛋白抗体-蛋白A-胶体金特异标记。同时,我们显示结合于核孔复合体上的胞质纤维被抗波形纤维蛋白抗体-蛋白A-胶体金所特异标记。本文结果表明,结合于核孔复合体上的胞质纤维是波形纤维,并且提示波形纤维可能通过与Nup 180的结合附着在核孔复合体上,为进一步探讨中间纤维与核孔运输的关系提供了初步实验证据。     

免疫胶体金标记显示波形纤维与核孔复合体的结合

中间纤维与细胞核的关系是一个亟待解决解决的重要问题。本文采用火鸡红细胞作为研究材料,首先用细胞分级抽提结合免疫印迹反应显示火鸡红细胞中间纤维蛋白为波形纤维蛋白。然后,我们采用细胞分级抽提结合包埋前免疫胶体金标记的方法显示胞质中间纤维被抗波形纤维蛋白抗体－蛋白Ａ－胶体金特异标记。同时,我们显示结合于核孔复合体上的胞质纤维被抗波形纤维蛋白抗体－蛋白Ａ－胶体金所特异标记。本文结果表明,结合于核孔复合体上     

铁线蕨中间纤维的研究及某些植物类角蛋白的比较分析

应用整装电镜制样技术,结合选择性抽提方法在铁线蕨（ＡｄｉａｎｔｕｍｐｈｉｌｉｐｐｅｎｓｅＬ．）叶细胞中观察到直径１０ｎｍ的纤维网络结构。免疫印迹结果显示：经选择性抽提得到的纤维蛋白与动物角蛋白抗体有免疫交叉反应,间接免疫荧光标记也得到类似结果,而且此类蛋白能在体外自组装为１０ｎｍ或更粗的纤维。说明蕨类植物细胞中存在类角蛋白中间纤维网络。免疫印迹结果表明,螺旋藻（ＳｐｉｒｕｌｉｎａｓｕｂｔｉｌｌｉｓｉｎａＫｕｔｚ．）细胞,地钱（ＭａｒｃｈａｎｔｉａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＬ．）叶状体,铁线蕨（Ａ．ｐｈｉｌｉｐｐｅｎｓｅＬ．）、银杏（ＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＬ．）、白菜（ＢｒａｓｉｃａｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓＲｕｐｒ．）的叶组织经选择性抽提后得到的蛋白均与动物角蛋白抗体有免疫交叉反应。其中,螺旋藻仅含有两种类酸性角蛋白,而其余４种植物材料均含有３种类酸性角蛋白及３种类碱性角蛋白。结合以往实验结果,我们认为类角蛋白在植物细胞中是普遍存在的。     

大鼠前体脂肪细胞分化过程中波形纤维形态结构的变化和波形纤维蛋白基因表达的研究

通过对不同分化阶段的大鼠前体脂肪细胞中波形纤维蛋白的结构形态和分布的间接免疫荧光观察,发现随着前体脂肪细胞的分化,波形纤维形态结构发生特异性改变,即从前期的围绕细胞核聚集且向细胞周边平行延伸到后期的围绕脂滴间隔形成致密笼状结构。此外,通过地高辛标记的寡核苷酸探针的原位杂交和免疫印迹研究了前体脂肪细胞的分化对波形纤维蛋白基因表达的影响。结果表明,分子量为57kD的波形纤维蛋白在mRNA水平和蛋白水平的表达贯穿于前体脂肪细胞分化的全过程,表达量呈递减趋势。这提示在前体脂肪细胞分化中,波形纤维与脂滴的特异性结合对于脂滴的前体脂肪细胞分化有着功能性的联系,特别是对脂肪细胞的脂滴形成极可能起到支撑的作用。     

组织型纤溶酶原激活剂A链与尿激酶原B链嵌合分子的构建与表达

利用 Ｄ Ｎ Ａ 重组技术和定位删除技术,将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ Ｐ Ａ）的 Ａ 链（ Ｓｅｒｌ Ｔｈｒ２６３）基因与尿激酶原（ｐｒｏ Ｕ Ｋ）的 Ｂ链（ Ｓｅｒ１３８ Ｌｅｕ４１１）基因相连,得到嵌合分子基因ｔｕ ｐａ,并在昆虫杆状病毒系统中进行表达,表达量可达 ５００ Ｉ Ｕ／ｍ ｌ．经单克隆抗体免疫亲和层析纯化细胞表达上清液,得到ｔｕ Ｐ Ａ 嵌合分子,其比活为 ２００ ０００ Ｉ Ｕ／ｍ ｇ 蛋白． Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 及 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定证明此表达产物分子量约为 ６０ ｋ Ｄ,与预期值相符．纤维蛋白平板测活及纤维蛋白亲和性分析初步证明,此嵌合分子的溶纤活性与ｐｒｏ Ｕ Ｋ 相近,而纤维蛋白亲和性高于 ｐｒｏ Ｕ Ｋ．     

Syp Y279和Y304介导了Bcr—Abl与Grb2等蛋白的结合

利用体外定点突变技术获得ＳｙｐＹ２７９Ｆ,Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ突变的ｃＤＮＡ,将这些突变体和野生型Ｓｙｐ分别构ｐＸＭ真核表达载体,转入Ｋ５６２细胞,经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明,各转染Ｋ５６２细胞中都有Ｓｙｐ蛋白的表达。免疫沉淀与免疫印迹结果发现ＷＴ,Ｙ２７９Ｆ,Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ等４种Ｓｙｐ在胞内均能直接与Ｂｃｒ－Ａｂｌ结合,体外结合实验结果表明Ｙ３０４Ｆ突变导致了Ｓｙｐ不能与Ｓｈｃ结合,Ｔ２     

SMAD4在嗜甲醇酵母中的表达及鉴定

Ｓｍａｄ４是新近发现的一种肿瘤抑制基因。在５０％的胰腺癌和３０％的结肠癌中,此基因发生突变或缺失。利用Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统,以胞外分泌的方法表达了ＳＭＡＤ４蛋白,并对ＳＭＡＤ４蛋白的生化性质进行了分析。结果显示表达蛋白的分子量约６７ｋＤ,经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定,与ＳＭＡＤ４抗全有特异的结合反应,Ｎ末端１３个氨基酸的序列与Ｓｍａｄ４ ｃＤＮＡ推断的序列完全一致。     

人脊髓前角运动神经元190KD蛋白的初步研究

本研究采用ＳＤＳ凝胶电泳方法从人脊神经前根中分离出人脊髓前角运动神经元特有的蛋白—１９０ＫＤ。将该蛋白作为抗原,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,经杂交瘤技术,获得了抗１９０ＫＤ蛋白的单克隆抗体。免疫细胞化学检测表明,１９０ＫＤ单抗与脊髓灰质前角神经元、前根及肌支发生阳性反应。实验结果提示,１９０ＫＤ蛋白分布在脊髓运动神经元胞体及脊神经的前根和肌支纤维中。     

S(yp) Y279和Y304介导了BcrAbl与Grb2等蛋白的结合

利用体外定点突变技术获得Ｓｙｐ Ｙ２７９Ｆ、Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ突变的ｃＤＮＡ, 将这些突变体和野生型Ｓｙｐ 分别构建入ｐＸＭ 真核表达载体, 转入Ｋ５６２ 细胞。经Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹证明, 各转染Ｋ５６２ 细胞中都有Ｓｙｐ 蛋白的表达。免疫沉淀与免疫印迹结果发现ＷＴ、Ｙ２７９Ｆ、Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ等４ 种Ｓｙｐ 在胞内均能直接与ＢｃｒＡｂｌ 结合。体外结合实验结果表明Ｙ３０４Ｆ突变导致了Ｓｙｐ 不能与Ｓｈｃ 结合,Ｙ２７９Ｆ突变则导致了Ｓｙｐ 不能与Ｇｒｂ２ 结合。结论是： 作为“接头蛋白”,Ｓｙｐ 可以介导ＢｃｒＡｂｌ 与Ｓｈｃ 和Ｇｒｂ２ 之间的结合;Ｇｒｂ２ 结合在Ｓｙｐ 的Ｙ２７９ 上,Ｓｈｃ 则结合在Ｓｙｐ的Ｙ３０４ 上     

PAI—2及其突变体的生物化学性质

为研究和比较纤深酶原激活剂抑制物２型（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ ２,ＰＡＩ－２）及其突变体的生物化学性质,用ＰＣＲ、体外定点突变技术构建ＰＡＩ－２突变体ＰＡＩ－２ＣＤ和ＰＡＩ－２ＱｃＤＮＡ,将突变体ｃＤＮＡ与原核表达载体重组并转化怕杆菌。经诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证实表达出相应蛋白质,均占全菌总蛋白的１４％。Ｗｅｔｅｒｎ印迹、溶圈抑制及纤维蛋白翻转板     

尿激酶抗人交联纤维蛋白-D-二聚体单抗化学偶合体的制备

利用双功能试剂Ｎ－琥珀酰亚胺－３（２－二硫吡啶）丙酸酯（ＳＰＤＰ）作交联剂,合成了尿激酶（ＵＫ）－抗人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体单抗（ＭＡ－ＨＩＤ１）化学偶合体（ＵＫＭＡ－ＨＩＤ１）,并用苯甲脒－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ及人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱纯化,获得偶合体产物．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ呈现一条带,其分子量约为２０００００．纤维蛋白平板法测活结果显示,偶合体中酶比活为５３０００ＩＵ／ｍｇ尿激酶蛋白,与偶联前的５４３００ＩＵ／ｍｇ蛋白相仿．ＥＬＩＳＡ测试显示,偶合体对人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体有免疫反应性,并且与偶联前的抗Ｄ－二聚体单抗对此抗原的反应性相当     

中国株丙型肝炎病毒（HCV）结构区蛋白在昆虫细胞中的表达及加工

利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了完整的中国河北株丙丙型肝炎病毒结构蛋白。免疫印迹实验结果显示,表达产物中有一系列分子量不同、可以与ＨＣＶ抗体阳性病人血清反应的蛋白,表明结构蛋白被宿主细胞蛋白酶切割与加工,相应分别为２０ｋＤ的核心蛋白、３２ｋＤ糖基化的Ｅ１蛋白４０ｋＤ的未糖化的Ｅ２蛋白和７０ｋＤ糖基化的Ｅ２蛋白,另有８０ｋＤ及１００ｋＤ的两组前体蛋白。利用表达产物检测慢性ＨＣＶ感染者血清,发现     

人腺病毒41型纤维丝状包涵体免疫电镜研究

为明确人腺病毒41型(Adenovirus type 41,Ad41)形态发生过程中形成的纤维丝状包涵体(Fibrillous inclusion body,FIB)是否含有Ad41的长纤维(Long fiber,LF)蛋白与短纤维(Short fiber,SF)蛋白。我们分别原核表达和纯化Ad41LF、SF的球部(Knob)蛋白,分别命名为LFK与SFK。以LFK和SFK分别免疫BALB/c小鼠,分别获得LFK抗血清和SFK抗血清。Western blot、间接免疫荧光和免疫负染结果表明,LFK抗血清和SFK抗血清分别与LF和SF结合,LFK抗血清和SFK抗血清之间无交叉反应,可以应用于免疫电镜标记。通过Ad41抗血清、腺病毒纤维单克隆抗体4D2、LFK抗血清与SFK抗血清分别对FIB进行免疫电镜胶体金标记,表明Ad41抗血清、腺病毒纤维单克隆抗体4D2、LFK抗血清与SFK抗血清均能标记FIB,说明FIB中含有Ad41长纤维蛋白和短纤维蛋白。     

植物细胞中NuMA类似蛋白的分布及其在细胞周期中的变化

免疫荧光染色结果说明植物细胞核内含有与抗动物ＮｕＭＡ多抗呈阳性交叉反应的多肽。选择性抽提并结合免疫荧光染色结果说明这种多肽位于核基质纤维蛋白网络上。免疫印迹反应显示胡萝卜（ＤａｕｃｕｓｃａｒｏｔａＬ．）悬浮培养细胞核基质蛋白与抗动物ＮｕＭＡ蛋白多抗的阳性反应条带为７４ｋＤ和７６ｋＤ。有丝分裂各期免疫荧光染色的结果表明植物细胞中的ＮｕＭＡ类似蛋白在有丝分裂过程中呈现有规律的变化。结合选择性抽提的有丝分裂各期的免疫荧光染色的结果表明核基质在此过程中也发生明显变化。应用选择性抽提并结合ＤＧＤ包埋去包埋电镜技术对植物细胞间期及有丝分裂期核基质的形态结构进行了观察。结果显示胡萝卜悬浮培养细胞间期核内存在一个非染色质性的纤维蛋白网络体系,而在正处于分裂的细胞中则未观察到。以上结果说明ＮｕＭＡ类似蛋白是核基质的组分之一并与有丝分裂密切相关。     

大鼠脑损伤后波形蛋白（Vimentin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学反应的观察

大鼠脑损伤后波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）和胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）免疫组织化学反应的观察周浩,叶诸榕,朱建辉（嘉定卫生学校病理科嘉定２０１８１０）本实验用针刺大鼠基底核观察星形胞质细胞Ｖｉｍｅｎｔｉｎ和ＧＦＡＰ的表达．采用雄性ＳＤ大鼠２５只针刺穿...     

一种与受精有关的人精子膜蛋白（BS—17）的分离纯化

本文盐分级分离,Ｍｏｎｏ Ｑ ＦＰＬＣ及ＳＤＳ－聚烯酰胺胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）等方法从人精子ＣＨＡＰＳ抽提液中分离纯化出一种与不育病血清中抗精子抗体发生特异反应的ＢＳ－１７人精子膜蛋白。该蛋白为一糖蛋白,分子量为１７．５５±２．１５ｋＤ,等电点为５．６５,中性己糖含是为１６．６７％。在人精子上主要分布于顶体区域,不同于已有报导的人精子膜蛋白。在体外实验中抗ＢＳ－１７多克隆血清可以显著影响人精子     

人碱性成纤维细胞生长因子基因克隆,cDNA5‘端修饰及在大 …

采用ｃＤＮＡ－ＰＣＲ技术,从人胎盘ｃＤＮＡ文库ＤＮＡ中克隆了人碱性成纤维在子（ｈｂＦＧＦ）基因,用ＰＣＲ突变法对其５＆端序列进行修饰,奖天然和修饰后的ｈｂＦＧＦ基因分别克隆至表达载体ｐＢＶ２２１,免疫抑迹和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果证明,经修饰后的基因在大肠杆菌ＤＳ５α中获得了表达,表达量占菌体总蛋白９％。     

丙型肝炎病毒RNA多聚酶在昆虫细胞中的表达

ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ基因片段克隆入ＢＡＣ－ＴＯ－ＢＡＣ＾ＴＭ重组杆状病毒表达系统的ｐＦＡＳＴＨＴｃ载体质粒,转化ＤＨ１０ＢＡＣ＾ＴＭ感受态细菌获得重组的Ｂａｃｍｉｄ质粒,将重组Ｂａｃｍｉｄ质粒转染Ｓｆ细胞,获得的重组杆状病毒可表达目的蛋白。免疫印迹和体外活性检测表明,所表达蛋白为ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ蛋白,具有多聚酶活性。     

重组含有Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)基因的杆状病毒在昆虫细胞中的表达

用杆状病毒表达系统重组病毒,在昆虫细胞中表达了完整的含有ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因３个外显子开放读码框架的长２．３ｋｂ的ｃＤＮＡ片段。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞,用免疫荧光染色,结果表明：４８小时表达重组蛋白,７２小时细胞较完整,免疫荧光染色强阳性,９６小时后细胞出现破碎。我们采集７２小时的组织培养上清和细胞破碎裂解液,分别采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ分子筛法,用免疫蛋白印迹法实验证明,表达的蛋白能被抗ＬＭＰ１的单克隆抗体所识别,测定表达蛋白的分子量为６０ｋＤ。经蛋白含量扫描图分析,采用Ｓｅｐｈａｄｅｘ－７５柱初步纯化表达的ＬＭＰ１蛋白,将后者进行裸鼠体内致瘤实验,未见肿瘤生长。