地钱(Marchantia polymorpha L.)培养物及其叶绿体DNA的研究

自从地钱(Marchantia polymorpha L.)雌配子体愈伤组织培养成功以来(Ono,K.1973),日本一些实验室相继利用它作为研究材料,但报道较少。有关工作可分四个方面:一,地钱雌配子体愈伤组织培养;二,地钱悬浮培养物的研究;三,地钱原生质体培养;四,地钱叶绿体DNA基因组结构及其复制机制的研究。     

烟草叶绿体基因组和线粒体基因组SSR位点分析

利用生物信息学方法对烟草叶绿体和线粒体基因组数据中的SSR信息进行了分析.结果表明,在叶绿体和线粒体基因组中分别获得186和578个SSR位点,SSR间的平均距离分别为838 bp和745 bp.在SSR的分布区域上,绝大多数SSR位点分布在UTR(尤其是5’UTR)区域;在SSR重复碱基类型上,主要集中在二、三碱基重复,二者占总SSR位点的90％以上,其中三碱基重复类型丰度最高.利用全部657对SSR引物在供试的10份烟草材料中进行扩增,发现所有引物均能获得目的片段,但在普通烟草内品种间并未检测到多态性,而在烟草种间有26对叶绿体基因组SSR引物和178对线粒体基因组SSR引物扩增出多态性条带,表明来源于烟草叶绿体基因组和线粒体基因组的SSR标记适合用于烟草种间进化、分类、遗传多样性等方面研究.     

叶绿体中蛋白质合成的调控

高等植物和绿藻的叶绿体有自己的遗传系统.烟草、欧龙亚草和水稻叶绿体DNA的全部核苷酸序列含有130个基因密码.除叶绿体rRNA和30tRNA的基因外,已发现至少有70个密码子的40个ORF和已确定的40个及未定的11个叶绿体蛋白质基因.在一些植物种中,rRNA基因组附近的某些基因组出现二个反向重复片段.人们把质体基因分成三类:(1)编码光合系统的蛋白质基因.光合作用中蛋白质的合成     

CRISPR/Cas系统在植物基因组编辑中的应用

在基因组水平上进行植物基因人工改造对农作物的改良具有重要意义。一直以来,科学家都未发现有效的植物基因组编辑的方法。最近发现的CRISPR/Cas系统因其简易和有效性被广泛应用于包括植物在内的多种生物的基因组编辑中。CRISPR/Cas系统仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变。目前CRISPR/Cas系统已成功在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、甜橙(Citrus sinensis)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)以及苔藓植物地钱(Marchantia polymorpha)等植物中实现了定点基因组编辑。综述将对CRISPR/Cas系统在植物中的最新研究进行全面的总结和讨论。     

水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离16S启动子,并在其下游加入rbcL基因SD序列,以增强该启动子的翻译能力;序列分析表明,除加入的SD序列外,扩增片段与水稻(Oryza sativa)叶绿体基因组DNA序列16S启动子相应区域同源性为100％。将16S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接,以psbA基因的3′序列为终止子,并以烟草叶绿体trnH—psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pRl6S。用基因枪转化烟草,转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析,发现：16S启动子具有启动活性,融合基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律。     

SARS亚基疫苗-突刺蛋白受体结合区RBD在烟草叶绿体中的高效表达

叶绿体表达系统为植物源重组药用蛋白和亚基疫苗的生产提供了一个有效的途径。为验证SARS亚基疫苗在叶绿体中表达的可行性,以及为植物源SARS亚基疫苗的生产提供一套高效、低成本的技术平台,本研究将人工优化合成的SARS-CoV突刺蛋白(S蛋白)受体结合区序列RBD与载体分子CTB融合基因导入烟草叶绿体基因组中。PCR和Southern杂交分析表明,外源融合基因已整合到烟草叶绿体基因组中,并获得同质化。Western杂交分析表明,重组融合蛋白CTB-RBD在叶绿体转基因烟草中获得表达,且主要以可溶性单体形式存在。ELISA分析表明,在不同生长阶段、不同生长部位和不同时间点烟草叶片中,重组融合蛋白CTB-RBD的表达水平呈现明显的变化。重组蛋白在成熟叶片中的表达水平最高可以达到10.2%TSP。本研究通过SARS亚基疫苗RBD在烟草叶绿体中的高效表达,有望为植物源SARS亚基疫苗的生产以及SARS血清抗体的检测提供一个有效的技术平台。     

萝卜叶绿体DNA花粉育性有关的特异片段的部分序列组成

本实验序列分析并精确定位了萝卜(Raphanus sativus)叶绿体DNA花粉育性片段B_(21)的部分序列(ZL1)。结果表明,ZL1片段长474bp,其碱基组成是AT丰富的。与烟草全序列的比较分析发现,该片段位于烟草全序列中反向重复区IR_A的142330到142803、IR_B的100199到99726区段,其核苷酸序列与相应的烟草序列比较有96.6%的同源性。该片段具有rps12—rps7操纵子的一部分结构,分别编码核糖体小亚基蛋白S12的C-末端的7个氨基酸残基和S7的N-末端的93个氨基酸残基。两者的氨基酸序列与烟草、玉米、地钱、眼虫藻,大肠杆菌及蓝细菌相应序列的同源性分别为71.4—100%及40—95.5%。 上述结果意味着叶绿体核糖体蛋白质可能和细胞质雄性不育性存在某种联系。     

甘薯叶绿体表达载体构建及其融合基因在叶绿体中的瞬间表达

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计引物,从甘薯(Ipomoea batatas)叶绿体基因组中克隆了2个相邻的功能基因rbcL(GenBank登录号为AY942199)和accD(GenBank登录号为AY942200),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段.以来自叶绿体基因组的强启动子Prrn和RpsbA-pro分别驱动选择标记基因aadA及phaC-gfp融合基因,构建成表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter与RpsbA-pro-phaC-gfp-RpsbA-ter,然后将这2个表达盒串联在一起克隆进甘薯叶绿体同源片段中,获得甘薯叶绿体定点整合表达载体pSC-GFP.酶切分析证明,所构建的载体符合预期设计;采用该载体对甘薯叶片进行基因枪转化,结果显示,phaC-gfp融合基因可在叶绿体特异启动子和终止子的调控下在甘薯幼嫩叶片中瞬间表达,证明构建的载体pSC-GFP可用于甘薯叶绿体转化.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径,本研究选择烟草叶绿体为表达平台,构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03,并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测,证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA分析表明,Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达,具有免疫活性。此外,种子萌发研究结果显示,转基因烟草植株F1代具有aadA抗性,目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。     

蓝藻与植物叶绿体光合系统基因的生物信息学研究

用BLAST法比较了蓝藻和叶绿体中编码光合系统蛋白的基因碱基序列的同源性,其中蓝藻来自集胞藻6803和念珠藻7120,叶绿体来自地钱、烟草、水稻、裸藻、黑松、玉米、紫菜、拟南芥等。以集胞藻6803的碱基序列为基准(100％),与其他物种进行同源性比较。在光系统Ⅰ基因中,psaC同源性最高(90．14％),最低的是psaJ,(52．24％)。光系统Ⅱ基因中,同源性最高的是psbD基因(83．7l％),最低的是psbN(49．70%)。ATP合成酶基因中,同源性最高的是atpB基因(79．58％,),最低的是atpF(26．69％)。细胞色素b6／f复合物基因中,同源性最高的是petB(81．66％),最低的是petA(55．27％)。这些数据可为叶绿体的起源和进化提供一些证据。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在烟草叶绿体中的表达（英文）

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)可读框2(open reading frame 2,ORF2)基因编码具有多个抗原表位的病毒衣壳(Cap)蛋白,能在机体内有效引发免疫反应并产生中和抗体,是预防和治疗猪圆环病毒病(porcine circovirus-associated disease, PCVAD)的主要抗原。但Cap蛋白高昂的生产成本限制了它的广泛应用。为了探索Cap蛋白新的生产途径,本研究选择烟草叶绿体为表达平台,构建了ORF2抗原基因烟草叶绿体表达载体pNK-a03,并通过基因枪法(gene biolistics)将表达载体导入烟草叶绿体中。转化植株经PCR和RT-PCR检测,证实ORF2抗原基因已整合进烟草叶绿体基因组中且正常转录。蛋白质印迹检测和ELISA分析表明,Cap蛋白在烟草叶绿体内获得有效表达,具有免疫活性。此外,种子萌发研究结果显示,转基因烟草植株F1代具有aadA抗性,目的基因可正常进行遗传。这些研究结果为探索Cap蛋白的新型表达途径提供了理论基础。     

濒危植物坡垒的叶绿体基因组特征及系统发育分析

了解濒危植物坡垒(Hopea hainanensis)的叶绿体基因组结构,对揭示龙脑香科植物的系统进化关系具有重要意义.本研究通过高通量测序技术对坡垒叶绿体基因组的结构特征及与其近缘种的系统进化关系进行了分析.结果 表明:坡垒叶绿体基因组具有典型被子植物叶绿体基因组的四分体结构,基因组全长151 795 bp,共注释得...     

极小种群濒危植物广西火桐、丹霞梧桐的叶绿体基因组特征

广西火桐(Firmiana kwangsiensis)和丹霞梧桐(F. danxiaensis)是我国南方特有物种, 其分布范围狭窄, 种群数量少。为了解其叶绿体基因组结构及系统发生关系, 本文通过高通量测序方法获得广西火桐和丹霞梧桐的浅层基因组数据, 通过生物信息学方法对叶绿体全基因组进行组装, 并对其结构特征进行分析。结果表明: 广西火桐和丹霞梧桐的叶绿体基因组大小分别为160,836 bp和161,253 bp, 具有典型被子植物叶绿体基因组环状四分体结构, 包含长度分别为89,700 bp、90,142 bp的大单拷贝区(large single copy, LSC), 长度分别为19,970 bp、20,067 bp的小单拷贝区(small single copy, SSC)及长度分别为25,583 bp、25,522 bp的2个反向重复序列区(inverted repeat sequence, IR)。两个物种的叶绿体基因组共注释得到131个基因, 包括86个蛋白编码基因、37个tRNA基因和8个rRNA基因。广西火桐的叶绿体基因组中共检测出26个正向重复序列、2个反向重复序列、21个回文重复序列、21个串联重复序列和98个简单重复序列; 丹霞梧桐叶绿体基因组中共检测出23个正向重复序列、5个反向重复序列、21个回文重复序列、30个串联重复序列和107个简单重复序列。系统发生分析结果表明5种梧桐属(Firmiana)植物构成两个强烈支持的分支(支持率100%), 一个分支为广西火桐、美丽火桐(F. pulcherrima)和火桐(F. colorata), 其中广西火桐与美丽火桐构成姐妹群; 另一分支是互为姐妹群的丹霞梧桐和云南梧桐(F. major)。综上所述, 广西火桐和丹霞梧桐的叶绿体基因组结构、基因排列及重复序列具有较高的相似性, 系统进化树将5种梧桐属物种分为两个分支, 其中广西火桐和美丽火桐最近; 而丹霞梧桐与云南梧桐关系最近。本研究鉴定的SSR位点可为梧桐属物种系统发生、进化关系的研究提供遗传信息。     

水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离16S启动子, 并在其下游加入rbcL基因SD序列,以增强该启动子的翻译能力;序列分析表明, 除加入的SD序列外, 扩增片段与水稻（Oryza sativa）叶绿体基因组DNA序列16S启动子相应区域同源性为100%。将16S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接,以psbA基因的3′序列为终止子, 并以烟草叶绿体trnH-psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pR16S。 用基因枪转化烟草, 转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析, 发现16S启动子具有启动活性, 融合基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律。     

甘薯叶绿体rbcL基因的克隆与序列分析

根据烟草、水稻和菠菜叶绿体的全基因组序列设计引物,以甘薯的叶绿体基因组DNA为模板,PCR扩增包舍甘暑叶绿体rbcL完整基因(GenBank登录号为AY942199)在内的一段序列.序列分析表明:此片段的全长为1 627 bp,包括1 443bp的编码区序列在内.推测编码480个氨基酸,同时构建了此片段的限制性酶切图谱.相似性比较显示,此基因编码区序列与烟草、菠菜、小麦、水稻、玉米、矮牵牛、紫花苜蓿、拟南芥、莨菪、葡萄以及甜菜的rbcL基因核苷酸的同源性为85%～98%,氨基酸的同源性为92%～95%.     

茄科植物叶绿体基因组插入、缺失和核苷酸替代的发生方式及影响

摘要: 核苷酸替代和indels(插入、缺失统称)发生是进化的重要动力。以茄科植物为研究对象, 探讨茄属中番茄和马铃薯、烟草属中绒毛状烟草和普通烟草分化时叶绿体基因组indels和核苷酸替代的发生方式, 以及这两种突变对基因组造成的影响。结果显示: indels和核苷酸替代的发生都不是随意的。indels发生在A+T丰富的区域, 1 bp indels占据总数的30%以上, 大部分indels都为低于10 bp的较短片段。核苷酸替代表现出Ts(转换)/Tv(颠换)偏差, 但T→G, A→C颠换频率却明显增加。Ts/Tv比值出现种属特异性, 番茄和马铃薯比较时替代的Ts/Tv比值低于绒毛状烟草和普通烟草比较时Ts/Tv比值。不同物种替代的(A+T)/(G+C)比值有一定差异, 从而影响基因组的(G+C)%, 此比值的差异与形成物种的生长习性有一定的关系。     

油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体的构建

根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。     

Bt基因甜菜叶绿体转化载体构建及毒蛋白表达

利用植物叶绿体基因组在进化中高度保守的特点,根据烟草、菠菜、水稻叶绿体基因组全序列资料设计合成引物,PCR扩增并克隆了甜菜叶绿体两个重要功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为DQ067450和DQ067451),并以其作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了Bt基因CryIAc甜菜叶绿体定点转化载体pSKARBt,酶切鉴定表明:所构建载体符合预期设计。对克隆菌菌体总蛋白进行了生物杀虫试验,结果表明:Bt基因CryIAc能够在叶绿体特异性启动子及终止子的调控下表达,并对二龄末甘蓝夜蛾有很强的毒杀作用。该载体构建对培育甜菜高抗虫品种具有重要应用价值。叶绿体转化及后续工作正在进行中。     

轮叶蒲桃叶绿体基因组特征及系统发育分析

轮叶蒲桃(Syzygium grijsii)系桃金娘科(Myrtaceae)蒲桃属(Syzygium)常绿灌木，其开发前景较好，但其叶绿体基因组特征及系统发育关系尚未有相关报道。为弥补轮叶蒲桃基因组学方面的空缺，该文对轮叶蒲桃的叶绿体基因组进行了系统的研究。运用Illumina高通量测序，并在GetOrganelle平台进行完整组装，同时利用组装好的数据分析轮叶蒲桃叶绿体基因组的结构特征和系统发育关系，其中包括轮叶蒲桃叶绿体基因组结构、功能及特征、密码子偏好性分析、叶绿体基因组的比较分析和系统发育的分析。结果表明：(1)轮叶蒲桃叶绿体基因组大小为158 591 bp,包含129个基因。其中，rRNA基因8个，tRNA基因37个，蛋白编码基因84个。分析检测到39个重复序列和84个SSR位点。(2)密码子偏好性分析发现轮叶蒲桃叶绿体基因组中末端存在对A/U的偏性，使用最多的是编码亮氨酸的密码子。(3)与近缘种比较，轮叶蒲桃的边界长度保守，边界处的基因种类与多个蒲桃属物种相似；轮叶蒲桃叶绿体基因组在LSC和SSC区变异度较大，有45处0.010i<0....     

稳定的叶绿体转移

直到最近,叶绿体基因组对于分子遗传学研究来说还是难以操作的。然而,去年年底植物遗传系统公司(Plant Genetic Systems)(布鲁塞尔,比利时)的Mark de Brock报道了叶绿体的转移,以及今年夏季名古屋大学的Shimozaki和京都大学的Ohyama小组取得的烟草和苔类植物叶绿体DNAs的完全序列,使叶绿体的转移有指望得到更迅速的发展。阿姆斯特丹Vrije大学Ad Kool研究室的Mart von Grinsven指出了要取得进展的一个