整体原位杂交检测ERα基因在小鼠胚胎发育中的表达

为制备地高辛标记的小鼠雌激素受体a(ERa)RNA探针,用其研究ERa在小鼠胚胎发育过程中的表达.通过RT-PCR,获得ERa基因片段,构建ERa/pGEM-3Z重组质粒,分别用Hind Ⅲ和EcpRI进行酶切得到线性化DNA片段,以17和sp6聚合酶合成地高辛标记的正反义RNA探针,然后通过胚胎整体原位杂交技术分析ERa在小鼠胚胎中的表达.结果构建了ERa/pGEM-3Z质粒,获得高效价的正反义digERaRNA探针.运用该探针检测到ERa在10.5 dpc胚胎的前脑、脊神经管、生殖嵴、肢芽及颌弓中表达,在13.5 dpc胚胎的端脑、中脑、脊髓、肢芽及生殖系统中表达,为进一步研究ERa在小鼠胚胎发育中的功能打下了基础.     

视黄酸对小鼠早期胚胎结构及0tx2基因表达的影响

以全反式视黄酸 ( all trans-retinoic acid,AT-RA)体外处理 EB( early allantoic bud)期和 LB( lateallantoic acid)期的小鼠胚胎 ,然后用洋地黄毒苷 ( digoxigenin)标记的 0 tx2反意义 RNA探针对整体胚胎进行原位杂交。以 4× 1 0 - 6 mol/ l的 AT— RA处理 ,抑制或减少了胚胎的前肠形成 ,经处理的胚胎的头褶没有对照的那样明显向腹部突出 ,其神经沟也不整齐 ;经处理的 EB期胚胎 ,其 0 tx2表达范围剧烈地向前退缩或只有很微弱的表达 ;但以同样浓度处理 LB期胚胎时 ,与对照相比 ,0 tx2的表达除了在极少数胚胎中变得弱一些以外 ,在绝大多数胚胎中其表达模式没有变化     

Cdk2apl在不同性别鸡胚中的表达

因有表达但在雌性胚胎对应部位却基本没有表达.鉴于该基因在雌雄鸡胚中的差异表达,推测cdk2apl基因在鸡胚性别分化及性腺发育过程中起一定调节作用.     

斑马鱼整体原位杂交的技术改良

斑马鱼整体原位杂交技术广泛应用于基因表达谱、基因间相互关系和突变体筛选等方面,是研究斑马鱼发育相关基因功能的重要技术。本文从杂交探针的制备、浓度的选择和洗脱以及胚胎的脱色、蛋白酶K消化、底物显色等方面进行了摸索、改进及简化,获得了背景低、着色清晰、特异性高的实验结果,预示了简单实用、成本低廉的斑马鱼整胚原位杂交技术平台的成功建立。     

RNA原位杂交技术的一些应用技巧

目的:检测基因在动物组织或细胞中的时空表达模式。方法:转录反义RNA探针;利用RNA原位杂交技术检测人和小鼠牙原基中若干基因的表达。结果与结论:通过优化条件,转录出完整的反义RNA探针,并成功地利用RNA原位杂交技术在组织中检测到基因的表达;分析了一些在RNA原位杂交的过程中可能碰到的问题及其解决方法。     

单分子荧光原位杂交（smFISH）技术及应用

单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization,smFISH）技术是一种通过用偶联荧光基团的寡核苷酸探针,对固定细胞或组织中单个mRNA分子进行成像的方法。smFISH可对RNA进行定位、定量,以此对目标转录本进行实时研究。smFISH适用于细胞、组织切片等多种类型生物样本。近年来,多种基于基础smFISH的改进技术被发明,进一步促进了该技术的实际应用。smFISH良好的RNA单分子可视化能力,使得其在发育生物学、神经生物学及肿瘤生物学等基础生物学科中得到了广泛的应用。本文综述了smFISH技术基本原理、smFISH技术的局限性、smFISH衍生技术方法、smFISH在不同生物学科中的应用进展,并对smFISH技术的发展前景做出展望。     

Cdk2ap1在不同性别鸡胚中的表达

为研究通过抑制消减杂交筛选出的cdk2ap1基因在鸡胚胎发育过程中的表达, 设计cdk2ap1引物并通过 RT-PCR扩增cdk2ap1基因片段, 构建cdk2ap1/pGEM-T重组质粒。以构建的重组质粒为模板, 使用Sp6和T7 RNA聚合酶合成地高辛(dig )标记的正、反义RNA探针, 借助胚胎整体原位杂交技术研究了cdk2ap1在雌雄鸡胚中的表达。结果表明cdk2ap1基因在4.0 d两性胚胎的脑间质、菱脑、听囊、脊神经管、前肢等部位均有表达, 且在雄性鸡胚中的表达量高于雌性; 在雄性鸡胚的生殖脊、后肢部位中该基因有表达但在雌性胚胎对应部位却基本没有表达。鉴于该基因在雌雄鸡胚中的差异表达, 推测cdk2ap1基因在鸡胚性别分化及性腺发育过程中起一定调节作用。     

地高辛标记Ucp2基因RNA探针的制备和应用

目的:制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法:提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。     

应用荧光原位杂交技术检测人类APPSWE基因在转基因小鼠染色体上的定位及位置效应

应用荧光原位杂交技术研究了人类淀粉样前体蛋白基因瑞典型突变（APPSWE）在转基因小鼠首建、F1及F2代小鼠染色体上的整合及定位,结果在2只首建转基因小鼠中,分别观察80个分裂相,出现杂交信号的核型分别为34及36个,检出率为42.5%和45%;1只F1及1只F2代转基因小鼠中,分别观察100个分裂相,出现杂交信号的核型分别为33及30个,检出率为33%和30%。转基因分别整合在8号、1号、17号和2号染色体上,提示转基因APPSWE已稳定整合到转基因小鼠的染色体上,并通过生殖细胞遗传给予子代,证实转基因在小鼠染色上的整合可能是随机的多点整合,同时,对不同整合位点的转基因小鼠进行了表型研究,结果发现不同整合位点对表型具明显影响。     

荧光原位杂交在膀胱癌检测中的应用进展

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤.目前膀胱癌的治疗效果不容乐观,因此肿瘤的早期诊断、早期治疗显得尤为重要.本文介绍了荧光原位杂交技术在膀胱癌早期诊断及预后监测应用中的研究进展.     

一种适于植物幼胚mRNA整体原位杂交的方法

A mRNA whole-mount in situ hybridization method is reported here for quick, direct analysis of the spatial and temporal mRNA expression patterns in plant young embryos. A cDNA clone THE3 (tobacco heart embryo 3) was isolated by differential screening from tobacco (Nicotiana tabacum L.) heart embryo cDNA library as compared with the globular embryo cDNA library. The distribution of THE3 mRNA in tobacco heart embryos and globular embryos was investigated by a whole-mount in situ hybridization technique, showing that THE 3 is preferentially expressed in heart embryos.     

生物素标记的人IL-6受体基因探针的制备及在细胞原位杂交中的应用

制备了人IL-6受体cDNA 1.7 kb片段及其胞外区近膜侧区段0.5kb片段,分别用生物素标记制备了人IL-6受体基因探针,用斑点杂交分析了探针的灵敏度和特异性,并将探针用于四种白血病细胞系的原位杂交。结果表明,探针的灵敏度可达15～125pg/μl、特异性较好,所检测的四种细胞的IL-6受体mRNA表达水平与其细胞膜表面IL-6受体表达水平相一致。     

A Simple and Reliable Technique to Combine Oligonucleotide Probe in Situ Hybridization with Neuronal Tract Tracing in Vertebrate Embryos

We describe a simple and reliable combination of in situ hybridization with neuronal tracing. The technique uses recent advances in the field of neuronal tract tracing including fast diffusing, low molecular weight dextran amines and fade resistant fluorescent dyes, and combines them with in situ hybridization using a sensitive Oligonucleotide probe. Using this technique we have investigated the mRNA encoding the trkB receptor for brain-derived neurotrophic factor in identified facial and vestibular afferent and efferent neurons. We found very low levels of trkB mRNA in facial efferent neurons, whereas in the vestibular afferent neurons, clear labeling for the trkB mRNA could be seen. This technique can be applied to the developing embryo to study topology of a variety of cellular markers with reference to neuronal population or fibers identified by their origin or target.     

DIG标记DNA探针检测noggin在爪蟾胚胎中的表达

整体原位杂交（Whole-mount in situ hybridization)用于基因表达定位和表达分布模式的研究,已经成为一种非常重要的手段。PCR方法进行探针标记,可以获得特异性高,片断大小可变的探针。采用DIG标记,检测已知基因noggin在爪蟾胚胎时空分布,所得结果与文献报道一致,表明PCR方法获得的DNA探针在一定的条件下可以用于爪蟾胚胎整体原位杂交。