用亲和层析法分离提纯红曲霉葡萄糖淀粉酶的不同分子型

葡萄糖淀粉酶(产生菌为红曲霉(Monascus rubiginosus Sato)AS3.3491)是多型性酶,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈三条区带,相应于AS3.2199(原使用菌株)所产生的E_3、E_4和E_5。由于这三个组分性质极为接近,提纯十分困难。我们曾用DEAE一纤维素柱层析和垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法分离得到了凝胶电泳     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的研究III．葡萄糖淀粉酶两个分子型的比较

红曲霉(Monascus sp.)AS 3.3491的葡萄糖淀粉酶具有多型性,将其中主要的两个分子型F,和E4 提纯到凝胶电泳均一制品,并进行了比较研究。其氨基酸组成相似,差别最大的足丝氨酸,桕差6个残基,其次是精氨酸,差3个残基,其他氢基酸柑同或相差少于2个残基。氨基末端均为天冬氨酸和丝氨酸,羧基术端为酪鲺酸。两型酶都是糖蛋白,含糖量稍有差别,E,为7％,E4 为9％。其组成单糖以甘露糖为主,萁次是半乳糖,还有痕量的木糖和葡萄糖。两型的分子量也很接近。根据氨基酸残基计算,Sephadex G-100 凝胶过滤和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测出的数值均在54,000左右。 两型的等电点(pl)差别也很小,E3 为4.00,E4为4.10。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶中糖肽结合方式的研究

红曲霉葡萄糖淀粉酶具有多型性,它的主要的两个型E3和E4都是糖蛋白。用气相色谱法测定了E3和E4中各种单糖组分。在E3中,糖残基数为：甘露糖16,半乳糖2,术糖2,阿拉伯糖2,葡萄糖l,总残基数为23;在E4中残基数为：甘露糖19,半乳糖3,木糖3,阿拉伯糖3,葡萄糖1,共29个残基。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶N-连接糖链的初步研究

 在加强了的碱性条件下对红曲霉葡萄糖淀粉酶进行β-消除反应,分离未发生消除的级分。对反应前后的样品进行糖组成及甲基化分析,证实了红曲霉葡萄糖淀粉酶上确有对β-消除有抵抗的含GlcNAc的糖链存在。     

垂直板型凝胶制备电泳及其在分离红曲霉葡萄糖淀粉酶中的应用

红曲霉葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,EC3.2.1.3)可用于由淀粉生产葡萄糖。为了解决生产中的一些问题,有必要对酶的作用原理进行较深入的研究。但是,红曲霉葡萄糖淀粉酶具有多形性,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为     

黑曲霉突变株分解生淀粉的葡萄糖淀粉酶的提纯及其…

黑曲霉突变株Ｔ－２１产生的葡萄糖淀粉酶具有多型性,在凝胶电泳上呈现很多蛋白质带,酶活力显色表明许多条（５条以上）均表现出淀粉酶活力,酶制剂浸出液通过硫酸铵分级沉淀,ＤＥＡＥ－纤维素柱层析,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０柱凝胶过滤和ＤＥＡＥ－纤维素柱再层析分离纯化到了一型能被生淀粉吸附和水解生淀粉的葡萄糖淀粉酶ＧＡＩ和用凝胶制备电泳分离纯化到一型既不为生淀粉吸附又不水解生淀粉的ＧＡＩＩ。ＧＡＩ被生小麦     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的研究I．提纯和结晶

红曲霉的葡萄糖淀粉酶具有多形性。经聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳可分离为几个距离很近的带,暂定为带1、2、3、4和5。酶制剂浸出液经硫酸铵盐析,凝胶过滤脱盐和DEAE一纤维紊柱层析,初步得到两个冼脱部分。部分I以带4为主,部分II以带3为主。两部分均提纯约2-5倍,收率合计27％a将部分I或II用硫酸铵沉淀出酶蛋白,再用逐步降低浓度的硫酸铵溶液在0℃抽提,然后在7屯放置数周,在盐饱和度为56、54、52％的抽提液中均出现结晶,结晶为针状,井聚成麦捆状、放射状或球状晶簇。长径可达50一100微米。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶形成过程的研究

红曲霉(Monascus sp．)的葡萄糖淀粉酶具有多型性。比较了原始菌株AS3.978及其变异株AS3．2199及AS3.3491所产生的葡萄糖淀粉酶的凝胶电泳图谱,证实了三者所产生的主要区带E3和F4是互相对应的。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

葡萄糖淀粉酶的结构和功能研究进展

葡萄糖淀粉酶是一种重要的工业酶制剂,属于糖苷水解酶,它将淀粉及类似物水解成β-葡萄糖。近年来,对葡萄糖淀粉酶的研究在酶学性质、结构组成、结构-功能关系等方面取得了长足的进展。本文对这些研究进展进行总结,并针对工业生产中的问题提出相应的解决途径。     

曲霉淀粉酶基因与转录调控研究进展*

本文总结了到目前为止已克隆到的曲霉淀粉酶基因,并阐述了已发现的与调控相关的元件和因子如：顺式作用正调控元件和反式作用正调控因子等,在此基础上提出了曲霉淀粉酶基因的转录调控方式,并简述了曲霉淀粉酶基因的应用前景。 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的通称,广泛存在于动植物和微生物中（张树政 1984）。由于淀粉酶在工农业上的重要价值,因此很早就有人对淀粉酶进行研究。我国50年代初,先后研究和生产米曲霉的α-淀粉酶用作消化剂和葡萄糖生产,将细菌产生的α-淀粉酶用于纺织品退浆、饴糖制造等(张树政 1984);随着分子生物学技…     

巨大芽孢杆菌淀粉酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

以λ噬菌体为载体,采用鸟枪法由B.megaterium基因组克隆得到了1个淀粉酶基因,并已被亚克隆到E.coli和B.subtilis中,其表达水平较B.megaterium高250倍。克隆株产生的淀粉酶对直链淀粉的早期水解产物主要为麦芽三糖和麦芽糖,随着水解时间的延长,又将它们转变为葡萄糖。同时能以麦芽三糖为底物水解为麦芽糖和葡萄糖。受体菌的平行提取物无上述水解活性。因而该酶被确定为糖化型α-淀粉酶。SDS-凝胶电泳法确定酶分子量为58000道尔顿。     

米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

【目的】获得米曲霉蛋白酶主要成分及其酶学性质。【方法】利用硫酸铵盐析,DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析对米曲霉所产蛋白酶系进行分离纯化,SDS-PAGE检测蛋白酶纯度和分子量,采用高效液相凝胶色谱分析两种蛋白酶酶解产物。【结果】从米曲霉所产蛋白酶系中分离纯化获得两种蛋白酶组分P1和P2,分子质量分别约为37 kD和45 kD。以酪蛋白为底物时,P1的Km=8.36 g/L,Vm=12.95μg/(mL·min),最适反应条件为pH 8.0、45°C;P2的Km=4.11 g/L,Vm=4.86μg/(mL·min),最适反应条件为pH 7.0、45°C。两种蛋白酶均对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低。P1和P2分别酶解大豆分离蛋白后水解产物中肽分子质量分布呈现出一定的差异。【结论】两种蛋白酶的酶学性质存在差异;两者对疏水氨基酸构成的肽键具有选择性,但其作用基团存在特异性。这些研究结果将为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供指导。     

曲霉属种间原生质体融合后病毒传递及遗传重组——Ⅱ.黑曲霉与米曲霉种间杂交

感染直径28-33纳米球形病毒的葡糖淀粉酶生产菌黑曲霉与无病毒生长较快的米曲霉通过原生质体融合杂交,获得两种形态不同的种间杂种。杂种Ⅰ经遗传及生化分析推测是二倍体,杂种Ⅱ不产孢子并生长较慢。两个杂种均感染了病毒,病毒形态、血清反应、衣壳多肽及核酸组份均与亲本黑曲霉的病毒相同。杂种诱发分离的后代中,多数包括亲代型黑曲霉分离子及其它分离子均感染了病毒,只有一个分离子和来自异核体的一个分离物例外,二者均产生亲代型米曲霉类型的孢子。这种亲代型分离表明病毒种间传递并非胞质遗传。 黑曲霉与米曲霉分属黑曲霉群及黄曲霉群,是曲霉属内亲缘关系远的种间杂交,迄今并无报道。杂种Ⅰ具有接近原始亲本的葡糖淀粉酶的产量及米曲毒的生长速度。     

大熊猫乳酸脱氢酶同工酶M_4胰酶水解后的HPLC肽谱分析

 比较了大熊猫与猪LDH-M_4用胰酶水解后的HPLC肽谱;对分离出的各个肽段测定了氨基酸组成与N-末端。经分析,在两者各有的35个肽段中,22个肽段有相同的氨基酸组成与N-末端且在HPLC图谱上有相同的保留时间。另外有13个肽段在氨基酸组成与保留时间上存在差异。对大熊猫LDH-M中部分肽段测定了氨基酸残基序列。结果表明,与结合NAD~+有关的12肽的序列与一级结构已知的猪LDH-M含有Cys165的相应肽段完全一样;在与底物结合部位含有His191的35肽中,两者只有一个氨基酸残基的差异。在N-端的21肽中,有3个残基出现差异;而在C-端的14肽中,仅出现一个残基的差异。     

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达王峥,周蓓芸,郑幼霞（中国科学院上海植物生理研究所,２０００３）关键词高温放线菌,β—淀粉酶,基因克隆β—淀粉酶是一种外切型淀粉水解酶,它从淀粉的非还原性末端依次水解α－１,４葡萄糖昔键,产生分构型的麦芽糖。内...     

红曲霉AS 3.3491葡萄糖淀粉酶形成的研究

对红曲霉AS3．3491供给易利用碳源,葡萄糖淀粉酶的形成受咀遏,cAMP可使之解阻遏。易利用碳源的迅速利用使培养液pH显著下降,实验发现各种提高培养液pH值的方法都能促进葡萄糖淀粉酶的形成。同时发现该菌株的五种类型的葡萄糖淀粉酶是随培养液pH的逐渐回升陆续形成的,且各型酶的出现都与培养液的一定pH值相关联。文中讨论了该菌株中葡萄糖淀粉酶形成的调控机制。     

黑曲霉突变株葡萄糖淀粉酶的底物特异性

黑曲霉(Aspergillus niger)突变株T-21葡萄糖淀粉酶(GAI)仅能水解多种淀粉及麦芽低聚糖生成唯一产物β-葡萄糖,其水解麦芽糖及麦芽三糖的速度分别为200和570mg葡萄糖·h^(-1)·mg^(-1).GAI水解α-1,4键的速度比水解α-1.6键快100多倍.除了马铃薯淀粉外,对其它淀粉及麦芽低聚糖几乎都能100%地水解,但不能水解环状糊精,其水解各麦芽低聚糖的最先产物都比原底物少一个葡萄糖单位,说明GAI为一外切型淀粉酶.GAI对麦芽糖、麦芽三糖、可溶性淀粉、糯米淀粉、糊精及糖原的Km值分别1.92mmol/L、0.38mmol/L、0.053%、0.045%、0.059%、及0.076%,V_(max)分别为590、1370、1270、1520、1120和1220mg葡萄糖·h^(-1)·mg^(-1).D-葡萄糖酸-δ-内酯及麦芽糖醇对此酶分别具有反竞争性抑制和混合性抑制.     

一株嗜热地衣芽孢杆菌及其产高温淀粉酶的初步研究

从云南腾冲热海热泉中分离到23株产高温淀粉酶的菌株,选取酶活最高的一株菌株进行生长特征、16S rRNA基因测序及系统进化分析表明,该菌株为嗜热的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),并命名为B.1icheniformis Tamy6。该菌株生长范围为37～70℃,最适生长温度为55℃。对该菌所产高温淀粉酶的性质研究表明:该酶在70℃具有最高催化效率,在98℃保温30min,仍有45%的活力,其最适反应pH为5.0。通过Native-PAGE酶谱分析表明菌株Tamy6的粗酶液中含有一种类型的淀粉酶。通过TLC分析水解淀粉产物表明,其产物主要为葡萄糖、麦芽糖及3～5个葡萄糖基的寡糖,说明菌株Tamy6所产淀粉酶为高温α-淀粉酶。