微生物酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展

D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)是半合成青霉素和头孢霉素的重要前体。综述了微生物酶法生产D-对羟基苯甘氨酸的方法种类及其优缺点并对酶的来源即菌种的选育方法做了总结。此外,还简介了基因工程领域内的研究状况。     

构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸

目的: 在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因(hyd)和D-氨甲酰水解酶基因(adc),构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。方法: 构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与P_acoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果: 成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0.8mmol/L的MnCl₂·4H₂O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达P_cdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝P_AE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14.32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论: 构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。     

用基因工程菌酶法和化学法制备-D-对羟基苯甘氨酸(英文)

D 对羟基苯甘氨酸 (D p HPG)是制备羟氨苄青霉素、羟氨苄头孢菌素和羟氨唑头孢菌素等β 内酰胺类抗生素的重要中间体 ,同时它也用于多种多肽类激素及农药的合成 .在D 对羟基苯甘氨酸的多种制备方法中 ,生物酶转化法具有原料易得、工艺简单、耗能少、产率高、成本低、光学纯度好、三废污染少等优势 .为利用生物酶转化法制备D 对羟基苯甘氨酸 ,首先用尿素、乙醛酸和苯酚合成底物D ,L 对羟基苯海因 ,然后利用D 海因酶基因工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht细胞作酶源 ,进行底物D ,L 对羟基苯海因到中间体N 氨基甲酰 D 对羟基苯甘氨酸的酶法转化 ,最后用化学法将N 氨基甲酰 D 对羟基苯甘氨酸进一步转化为D 对羟基苯甘氨酸 .结果表明 ,底物D ,L 对羟基苯海因的收率为 60 % .8L体积的发酵小试实验表明 ,发酵 12h ,工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht的海因酶活力为 30 0 0U L ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳薄层扫描结果显示海因酶表达量约占菌体总可溶性蛋白质的 60 % ,菌体收率为 6% .8L体积的海因酶转化实验表明 ,在 4 %底物D ,L 对羟基苯海因和 1%菌体 (湿重 )pH 9 0情况下 ,反应 5h ,D ,L 对羟基苯海因的转化率可达 96% .在酸性条件下 ,用NaNO2 将N 氨基甲酰 D 对羟基苯甘氨酸转化为D 对羟基苯甘氨酸 ,反应 2h ,转     

基因工程酶法生产N-氨基甲酰-D-对羟基苯甘氨酸反应条件的优化(英文)

为了实现利用生物酶转化法生产D 对羟基苯甘氨酸 ,以工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht细胞作酶源 ,对底物对羟基苯海因到中间体N 氨基甲酰 D 对羟基苯甘氨酸的酶转化条件进行了优化 .酶转化的最适温度为 37℃ ,最适pH为 9 0 .在Tris HCl、磷酸盐、碳酸盐和硼酸盐 4种缓冲体系中 ,底物对羟基苯海因的转化率相近 .菌体细胞经适当冻融后 ,底物对羟基苯海因的转化率被提高 .水溶性有机溶剂DMSF、DMF和Tween 80使对羟基苯海因的转化率降低 .转化时底物和菌体的合适比例为 30g L对羟基苯海因和 10g L湿菌体 .经工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht细胞催化 ,底物的转化率在 13h内可达到 96 % .所制备的产物熔点、旋光性和红外光谱等与标准品一致     

异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建

【目的】构建异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的重组枯草芽孢杆菌,探讨其作为全细胞催化剂合成D-对羟基苯甘氨酸的可行性。【方法】采用P_(aco)表达盒表达D-海因酶基因hyd或sd1,采用P_(AE)表达盒表达N-氨甲酰水解酶基因adc。分别以质粒pHP13和pUB110为载体,构建D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达质粒pHCS、pHCY和pUCS。在受体菌中整合表达了acoR和sigL基因,敲除了skf和sdp基因。将共表达质粒分别转化不同的受体菌,通过测定全细胞催化活性,表征D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的效果。【结果】带有质粒pHCY和pHCS的重组菌,全细胞催化活性分别为0.21 U/mL和0.31 U/mL。整合表达acoR和sigL基因以及高拷贝质粒pUCS,使全细胞催化活性达到1.0 U/mL。【结论】异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶在枯草芽孢杆菌中能够正确表达。基因拷贝数、acoR和sigL基因表达水平,及skf和sdp基因缺失对重组菌的催化活性具有显著影响。     

生物酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究

生物酶法生产D-对羟基苯甘氨酸具有良好的应用前景。通过介绍生物酶法生产D-对羟基苯甘氨酸的研究现状,从酶的分离纯化、酶和细胞的固定化、反应介质研究和反应动力学研究以及基因工程进展几个方面作了总结。     

聚苯乙烯树脂固定化D-海因酶的初步研究

D-海因酶广泛用于D-氨基酸的制备研究和生产中,目前已有许多固定化D-海因酶及含D-海因酶细胞的研究报道。尝试了不同功能基团的聚苯乙烯树脂进行D-海因酶的固定化,结果表明功能基为伯氨基和仲氨基效果较好,并选取聚苯乙烯树脂D92进行了固定化D-海因酶的研究。采用该树脂制备固定化酶的最优条件是：酶质量浓度6mg／mL、温度25℃、固化时间12h。所得固定化酶的最适作用温度45℃,最适作用pH为8.5,且作用温度及适宜pH较广,Km为游离酶的1,8倍,且储存稳定性、操作稳定性较好。45℃下半衰期为11d。     

L-海因酶与D-海因酶的序列及结构比较研究

运用生物信息学的研究方法,从序列及结构上对L型及D型海因酶进行了初步的比较。研究了两种类型的海因酶在序列、骨架结构及活性中心的区别,并探讨了产生这些差异的理论基础,为海因酶进一步的理论及应用研究提供一定的指导。     

利用基因工程菌HC01固定化细胞转化生产D-对羟基苯甘氨酸

对一菌两酶工程菌HC01转化底物DL-对羟基苯海因(DL-HPH)的最适条件及其细胞固定化进行了研究,HC01游离细胞转化DL-HPH的最适条件为40°C、pH7.5。通过对固定化细胞酶活力测定,确定细胞固定化的最优条件为海藻酸钠浓度2.5%、细胞浓度0.029g/mL、钙离子浓度3%。固定化HC01的热稳定性比游离细胞高5°C,二价金属离子Mn2+、Mg2+、Cu2+、Co2+和Ni2+在浓度为0.1mmol/L时对固定化细胞中D-海因酶(HYD)和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)两酶的活力无显著影响,Mn2+和Mg2+可分别使游离细胞中CAB活力提高至原来的2.1和2.7倍。在氮气保护下,当初始pH为9.0、转化温度为40°C、转速为80r/min,利用固定化HC01转化30g/L的DL-HPH时,36h后转化率可达97%左右,产物D-HPG经纯化后光学纯度达到99.7%,得率可达85%。     

海因酶产生菌SHNU01的包埋固定化研究

对从土壤中筛选得到的高选择性产D-海因酶菌株SHNU01的性质进行了研究并探讨了用PVA-硼酸法进行包埋固定的效果。研究结果显示:固定化后的细胞与游离细胞相比,最适反应温度由游离细胞的37℃上升为47℃,在此温度下固定化细胞的酶活可达到游离细胞的3倍;连续反应7批后,固定化细胞活力为初始活力的80%。固定化细胞在操作稳定性、贮存稳定性等方面较游离细胞也有较大提高。     

假单胞菌海因酶基因在大肠杆菌中的高效表达(英文)

为实现利用生物酶转化法进行D 对羟基苯甘氨酸的工业化生产 ,构建了 3株海因酶基因工程菌 .利用PCR技术从恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)CPU 980 1染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因 .通过将海因酶全基因插入pMD18 T质粒、海因酶基因的编码区与pET 17 b质粒重组、海因酶基因编码区和T7强启动子一起插入pMD18 T质粒分别得到重组质粒pMD dht、pET dht和pMD T7 dht.将上述重组质粒分别转化大肠杆菌 (Escherichiacoli) ,通过地高辛标记菌落原位杂交和海因酶活力测定两种方法 ,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子 .结果表明 ,大肠杆菌的RNA聚合酶能够识别和结合来自恶臭假单胞菌海因酶基因的自身启动子 ,该启动子在大肠杆菌中能够工作 .基因工程菌E .coliBL2 1 pMD dht、E .coliBL2 1 pET dht和E .coliBL2 1 pMD T7 dht的海因酶活力分别为 170 0U L、190 0U L和 2 5 0 0U L ,比野生菌P .putidaCPU 980 1的海因酶活力分别提高了 8倍、9倍和 12倍 .薄层扫描结果显示 ,这些工程菌的海因酶表达量分别约占菌体总可溶性蛋白质的 2 0 %、31%和 5 7%.SDS PAGE显示 ,海因酶的单体分子量约为 5 0kD .经工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht催化 ,底物对羟基苯海因的转化率在 13h内可达到 9     

基因工程微生物的环境监测及生物防御体系研究进展

随着生物技术的发展, 研究人员构建出了大量具有特定功能的基因工程微生物, 这些基因工程微生物在实际应用时常受到限制, 因为它们释放到环境中有可能带来新的污染。为了减少或消除其对环境的潜在危害, 有必要采取措施对这些基因工程微生物进行监测和安全控制。通常要求这类基因工程微生物带有便于监测的检测标记以及能进行自消亡的主动生物防御体系。对基因工程微生物的检测标记以及主动生物防御体系的研究现状进行了综述。     

基因工程微生物的环境监测及生物防御体系研究进展

随着生物技术的发展, 研究人员构建出了大量具有特定功能的基因工程微生物, 这些基因工程微生物在实际应用时常受到限制, 因为它们释放到环境中有可能带来新的污染。为了减少或消除其对环境的潜在危害, 有必要采取措施对这些基因工程微生物进行监测和安全控制。通常要求这类基因工程微生物带有便于监测的检测标记以及能进行自消亡的主动生物防御体系。对基因工程微生物的检测标记以及主动生物防御体系的研究现状进行了综述。     

合成生物学技术在糖胺聚糖生产中的应用

糖胺聚糖是一类直链酸性多糖,具有优良的生物相容性和生理活性,被广泛应用于临床治疗,并用作药物运输载体,其中透明质酸、 肝素和硫酸软骨素的相关研究最为深入。由于传统方式（如动物组织提取法等）制备糖胺聚糖,存在外毒素、病毒等致病因子污染的风 险,因而,利用合成生物学技术,构建重组工程菌株生产糖胺聚糖,逐渐受到研究者们的重视。主要围绕透明质酸、肝素前体及软骨素, 综述糖胺聚糖的生物合成途径,并探讨产糖胺聚糖基因工程菌的构建以及糖胺聚糖生物合成过程中分子质量调控机制,以期为构建产高 品质糖胺聚糖工程菌株提供新思路。