一株蟾毒灵转化菌株的筛选鉴定与转化条件优化

【背景】微生物转化是对天然产物进行结构修饰的重要手段,具有催化反应快、选择性强、反应条件易控制和污染小等特点。许多微生物能够对蟾毒配基类化合物进行生物转化,在不同位置进行结构修饰,并且产生毒性减弱的活性衍生物。【目的】筛选蟾毒灵生物转化菌株,以期发现活性更好、毒性降低的化合物。【方法】利用蟾毒灵为底物筛选其生物转化菌株,通过HPLC (High performance liquid chromatography)/LC-MS (Liquid chromatograph-mass spectrometer)鉴定转化产物;对可生物转化蟾毒灵的菌株进行菌落形态观察和分子生物学鉴定,并优化发酵条件提高转化率,同时测试该菌株对其他甾体化合物的转化作用。【结果】筛选获得一株蟾毒灵转化菌,经形态学与ITS (Internal transcribed spacer)分析鉴定为Naganishia属菌,转化产物为3-去氢蟾毒灵。该菌株生物转化的培养基最适底物浓度为8 mg/L,最适初始pH值为6.5,最佳接种量为3%,最佳转化时间为96 h,最终转化率为48.3%。该菌株可将雌酮E1转化为雌二醇E2,也可将雌二醇E2逆向转化为E1。【结论】首次发现Naganishia属菌株对甾体类化合物具有转化活性,其产生的弱细胞毒性的转化产物3-去氢蟾毒灵有望成为高效、安全的强心药物。微生物转化法选择性高、反应条件温和、操作简单,为大量制备活性化合物3-去氢蟾毒灵提供了一条简便易行的道路,也为更多甾体化合物结构修饰提供了可能。     

一株Monacolin K高产菌株生理特性

根据丝状真菌的常用鉴定方法,对实验室保存的一株Monacolin K高产菌株进行形态和生理特性实验。结果表明该菌株属于真菌门(Eumycophyta)、子囊菌纲(Asomycetes)、真子囊菌亚纲(Eurotiaceae)、曲霉目(Eurrotiales)、曲霉科(Eurotiaceae)、红曲霉属(Monascus)。     

一株发酵转化黄芩苷菌株的筛选及鉴定

为实现生物发酵法转化黄芩苷生产活性产物黄芩素,本研究从自然发毛的新鲜黄芩植株根部筛选发酵转化黄芩苷生成黄芩素的菌株,并进行产物分析和菌株鉴定。通过马铃薯葡萄糖培养液(PDB)富集,黄芩药粉培养液初筛,马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板分离后转入PDB黄芩苷培养液复筛,高效液相色谱法定性及定量分析,得到一株能够高效转化黄芩苷为黄芩素的菌株RM3,该菌在添加0. 1%黄芩苷的PDB培养液中能够将黄芩苷转化为黄芩素,未经任何优化条件下,28℃,150 rpm培养5天后摩尔转化率达到83. 87%。通过对菌落的形态、显微结构观察及ITS序列分析比对,鉴定菌株RM3为青霉菌(Penicillium sp. RM3)。该菌转化黄芩苷生成黄芩素效率高,且清洁环保,可缓解中药资源紧张,满足市场和临床需求,是一株很有前途的黄芩素生产菌。     

一株烟酸羟基化转化菌株的筛选和鉴定

从南京地区的土壤中筛选到一株高效转化烟酸为 6_羟基烟酸的菌株NA_1。形态及生理生化特征测定结果表明 ,NA_1菌株与假单胞菌属 (Pseudomonas)中的恶臭假单胞菌 (P .putida)种的特征基本一致。测定了该菌株的16SrDNA序列并根据 16SrDNA构建了系统发育树 ;在系统发育树中 ,NA_1菌株与恶臭假单胞菌形成一个类群 ,序列同源性为 99%。因此将NA_1菌株鉴定为恶臭假单胞菌     

一株吡虫啉羟基化菌株及其转化产物的鉴定

从南京地区的土壤中筛选出一株命名为NJ2的菌株,该菌株的静息细胞可催化杀虫剂吡虫啉为一种极性更大的化合物。经BioMerieux Vitek自动微生物分析系统仪和16S rDNA序列分析,NJ2菌株鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。采用有机溶剂萃取和重结晶可得到转化产物晶体,质谱分析结果显示转化产物分子离子峰为272,而底物分子离子峰为256,表明转化产物为吡虫啉的羟基化产物。核磁共振分析进一步表明羟基位于吡虫啉咪唑烷环上的5′碳原子上。转化动力学测试结果表明,转化10d后,吡虫啉的含量减少了1.15mmol/L,转化产物的含量达到1.10mmol/L,摩尔转化系数为95.9%。S.maltophiliaNJ2持续转化能力强和高摩尔转换系数的特点,可用于工业生产羟基吡虫啉并进一步合成更高杀虫活性的烯式吡虫啉。     

人肠道产柚苷酶菌株分离、鉴定及其对柚皮苷的转化特性

【目的】从健康人肠道微生物菌群中分离能将柚皮苷高效转化为柚皮素的特定细菌菌株,对分离得到的菌株进行菌种鉴定并研究菌株对柚皮苷转化特性,目的是为柚皮素的高效生物合成提供新细菌资源。【方法】取健康人新鲜粪样,在厌氧工作站内培养24 h后进行梯度稀释并涂板,从板上挑取单菌落与底物柚皮苷进行厌氧培养,用高效液相色谱检测底物被转化情况。根据16S rDNA序列及相关生理生化特性分析,对所分离的柚皮苷转化菌进行菌种鉴定,并测定转化菌株对底物柚皮苷的转化动态和转化能力。【结果】从人肠道菌群中分离得到4株能将柚皮苷转化为柚皮素的细菌菌株,分别命名为AUH-JLD3、AUH-JLD7、AUHJLD104和AUH-JLD109。根据16S rDNA序列分析,结合形态学及相关生理生化特性等,将其分别鉴定为布劳特氏菌(Blautia sp.AUH-JLD3)、肠球菌(Enterococcus sp.AUH-JLD7)、拟杆菌(Bacteroides sp.AUHJLD104)和巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus subsp.AUH-JLD109)。转化动态研究结果表明,所分离的4株细菌菌株均能在12 h内将0.2 mmol/L底物柚皮苷转化为柚皮素;转化能力测定结果显示,菌株AUHJLD3、AUH-JLD7、AUH-JLD104及AUH-JLD109能够高效转化底物柚皮苷的最大浓度分别为0.2 mmol/L(平均转化率66.67%)、0.8 mmol/L(平均转化率86.49%)、0.2 mmol/L(平均转化率73.68%)以及1.6 mmol/L(平均转化率93.20%)。【结论】本研究首次从人肠道菌群中分离得到4株能将柚皮苷转化为柚皮素的细菌菌株,其中巴氏链球菌AUH-JLD109对底物柚皮苷转化能力最强。     

一株高产Monacolin K紫红曲霉菌株筛选、鉴定及发酵条件优化

为从天然发酵红曲米中分离的30株红曲霉菌株中筛选高产MonacolinK的菌株,并对其产MonacolinK的发酵条件进行优化。实验采用高效液相色谱法(HPLC)筛选到9株具有产MonacolinK能力的红曲霉菌株,其中以编号ZX26的菌株产MonacolinK能力最高,发酵液中Monacolin K产量达到107.6mg/L,并且产MonacolinK能力具有良好的稳定性。微生物形态学结合ITS基因同源性分析结果表明,编号ZX26菌株为紫红曲霉。进一步采用单因素试验和正交试验法优化紫红曲霉ZX26产MonacolinK的发酵条件,结果表明在培养基组分为葡萄糖70g/L,牛肉膏15g/L,NaNO32g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO41.5g/L时,其最优发酵条件为:发酵初始pH4.0,接种量为7%,培养温度30℃,发酵10天,在此条件下,紫红曲霉ZX26发酵液中MonacolinK产量达到271.36mg/L,相对于培养条件优化前MonacolinK产量提高152.19%,经验证此培养条件下MonacolinK产量最佳。     

一株转化大豆苷元为S-雌马酚菌株的筛选和鉴定

【目的】筛选一株可转化大豆苷元为S-雌马酚的微生物菌株,并对该菌株进行鉴定。【方法】在厌氧条件下采用抗生素抑制非目标菌生长并结合稀释涂平板法进行菌株分离,分离可转化大豆苷元生成S-雌马酚的肠道细菌,并对产物进行结构鉴定。之后通过16S rDNA序列分析,构建该菌系统进化树,结合菌体形态及菌落特征,确立该菌系统发育学地位。【结果】从大鼠肠道内筛选分离到一株可以将大豆苷元转化为S-雌马酚的革兰氏阴性兼性厌氧菌株LH-52(JN861767),16S rDNA序列测序结果 BLAST比对表明该菌株与奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)相似度达到了99%,结合形态特征和生理生化实验结果鉴定该菌为奇异变形杆菌。根据HPLC保留时间、质谱、核磁共振等波谱数据分析确定产物为S-雌马酚。【结论】菌株P.mirabilis LH-52为首次筛选到的可转化大豆苷元为S-雌马酚的兼性厌氧菌,相对于文献报道的严格厌氧菌更适合于工业化生产。     

一株高效转化Phytosterol为雄甾烯酮菌株的筛选与鉴定

从保藏的200多株菌中筛选出1株高效转化植物甾醇为4-烯-雄甾-3,17-二酮和1,4-二烯-雄甾-3,17-二酮的菌株,并对该菌进行了形态、生理生化的研究。结果发现菌株ST06可以利用多种碳源,可以水解淀粉,但不利用纤微素。用16SrDNA的方法对其进行鉴定,发现与Bacillus属Bacillus amyloiquefaciens的相似性最高,达到99．9％,将该菌株命名为Bacillus amyloiquefaciens ST06。该菌在培养温度30℃,pH7．0,转速220r／min,转化时间7d,底物添加量为0．3％时,ADD与AD的总得率高达40％以上,此时底物转化率高达93．7％。     

一株产类胡萝卜素菌株的分离与鉴定

本文报道了一株产类胡萝卜素株分离鉴定的结果,根据该菌的形态学特征、培养特征、细胞壁组分析及血清学反应,该菌株应归为红球菌属的一个种（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）。     

水溶性红曲中MonacolinK的稳定性

对红曲中Monacolin K（MK）在水溶液中的稳定性进行研究,考察不同加热温度、时间、pH、盐、维生素C（VC）、氨基酸、蔗糖质量浓度、光照和存放时间对其稳定性的影响。结果表明：100℃保温30min,水溶液中Monacolin K的浓度比20℃保温相同时间仅下降了4．6％。热处理、长时间光照对水溶液中Monacolin K有轻微的破坏作用：pH〈5．0,盐、VC、氨基酸的添加可降低水溶液Monacolin K溶解度。pH〈4．0可使酸型Monacolin K转化为内酯型。在Monacolin K水溶液中添加30g/L蔗糖可使水溶液中Monacolin K饱和质量浓度增至632．9mg／L。     

红曲霉液态发酵生产Monacolin K培养基的优化

利用正交试验设计对红曲霉TQ-57发酵生产Monacolin K的摇瓶发酵培养基进行了初步研究。结果表明:Monacolin K的最适发酵碳源为甘油,最佳添加质量分数为14%,最适氮源为蛋白胨,最佳氮源质量分数为3%,培养基初始pH为6.5,培养周期为8 d,在此条件下Monacolin K产量可达27.75 mg/L。     

红曲霉发酵生产Monacolin K的研究进展

红曲中的Monacolin K,作为一种抑制胆固醇合成的活性物质,是公认的降低胆固醇的理想药剂,具有高效、低毒、安全的特点.对红曲霉发酵生产Monacolin K的研究进展进行了综述,阐述了Monacolin K的理化性质,对Monacolin K抑制胆固醇合成的作用机理进行了论述,并综述了如何提高Monacolin K含量的途径和检测方法,叙述了毒性物质桔霉素的产生原因和解决方法.     

紫色红曲霉Mp-24高产Monacolin K发酵工艺响应面优化

将单因素实验结果与响应面法相结合,对高产Monacolin K的紫色红曲霉Mp-24菌株进行发酵工艺条件优化。通过摇瓶发酵对碳源、氮源、碳源含量、氮源含量、培养时间等进行单因素优化,确定Mp-24菌株摇瓶发酵适宜条件：乳糖为碳源、酵母膏为氮源、碳源含量7%、氮源含量2%、培养时间12 d,Monacolin K产量为167 mg/L。应用Box-Behnken中心组合试验设计建立数学模型,进行响应面分析优化发酵条件,结果显示最佳发酵工艺条件为：碳源(乳糖)8%,氮源(酵母膏)3%,培养时间11 d,在此条件下Monacolin K的含量达到247.8 mg/L,比优化前提高1.5倍。     

Arthrobacter K1108乙内酰脲酶转化产物的鉴定

用 Arthrobacter sp.K1 1 0 8的完整细胞为酶源 ,对 DL- 5 -苄基乙内酰脲进行了酶法转化 ,对转化产物进行了提取和精制 ,并通过理化分析和光谱分析进行了鉴定 ,证实所得产物确实为 L-苯丙氨酸 ,同时证实 K1 1 0 8的乙内酰脲酶是 L-选择性的     

Production of the secondary metabolites γ-aminobutyric acid and monacolin K by <Emphasis Type="Italic">Monascus</Emphasis>

γ-Aminobutyric acid (GABA), a hypotensive agent, and monacolin K, a cholesterol-lowering drug, can be produced by Monascus spp. Under optimal culture conditions, the products of fermentation using Monascus spp. may serve as a multi-functional dietary supplement and can prevent heart disease. In this study, Monascus purpureus CCRC 31615, the strain with the highest amount of monacolin K, was identified from 16 strains using solid fermentation. Its GABA productivity was particularly high. Addition of sodium nitrate during solid-state fermentation of M. purpureus CCRC 31615 improved the productivity of monacolin K and GABA to 378 mg/kg and 1,267.6 mg/kg, respectively. GABA productivity increased further to 1,493.6 mg/kg when dipotassium hydrophosphate was added to the medium. Electronic Publication     

氨基酸对于Monascus ruber生物合成Monacolin K影响的研究

在Monacolin K发酵中添加氨基酸后发现较高质量浓度的氨基酸高度抑制了Monacolin K的产量。0.1 g.L-1的D-甲硫氨酸在发酵第4 d添加可以提高产量30%以上,而L-甲硫氨酸则没有此功能,D,L-甲硫氨酸因D-甲硫氨酸的关系也有一定的增产效果。以甲硫氨酸代替蛋白胨作为主要氮源,则抑制了polyketide途径的前期步骤,因此严重抑制了色素及Monacolin K的生产。另外,发现1 g.L-1的L-苯丙氨酸的添加时间越早越有利于Monacolin K的生产,在起始时添加发酵单位可达135.9 mg.L-1,可能是因为L-苯丙氨酸经过脱氨后,可以进入polyketide途径从而促进了Monacolin K的生产。     

Simultaneous Enrichment of Deglycosylated Ginsenosides and Monacolin K in Red Ginseng by Fermentation with Monascus pilosus

To improve its bioavailability and pharmacological effects in humans, red ginseng was fermented with a newly isolated fungus, Monascus pilosus KMU103. Most of the ginsenosides were converted to deglycosylated ginsenocides, such as Rh₁, Rh₂, and Rg₃. The total amount of ginsenosides Rh₁, Rh₂, and Rg₃ was 838.7 mg/kg in the red ginseng, and increased to 4,117 mg/kg after 50 L fermentation in 13% red ginseng and 2% glucose. In addition, the Monascus-fermented red ginseng contained 3,089 mg/kg of monacolin K, one of the metabolites produced by Monascus known to reduce cholesterol in the blood. This newly developed Monascus-fermented red ginseng should result in improved health effects, not only by biotransforming gisenosides to deglycosylated ones but also by creating additional bioactive compounds.