斜带石斑鱼CD4基因克隆和组织表达分析

CD4 作为TCR的共受体可以提高TCR/抗原-MHC复合体的稳定性,辅助TCR识别抗原,并且参与T细胞活化.本研究从斜带石斑鱼Epinephelus coioides头肾中克隆得到全长2240 bp的CDM cDNA序列,该序列包含长1410 bp的ORF,编码469个氨基酸,预测蛋白分子包含一段信号肽,4个Ig样区...     

斜带石斑鱼L-氨基酸氧化酶基因克隆及表达分析

鱼类的L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase, LAAO)具有广泛的抑菌杀虫效果,为了解斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)LAAO基因序列特征及其在刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染后的表达变化,该试验克隆得到2个石斑鱼LAAO基因:EcLAAO-1和EcLAAO-2,它们的ORF长度分别为1536和1569 bp,编码511和522个氨基酸,均含有氨基酸氧化酶(Amino_oxidase)结构域以及LAAO保守序列:DBM和GG motif。多重序列比对显示石斑鱼LAAO与其他鱼类LAAO具有较高的相似性。系统进化树分析表明,斜带石斑鱼的LAAO与硬骨鱼类亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测结果显示EcLAAO-1和EcLAAO-2在石斑鱼各组织均有表达,其中皮肤、鳃、胸腺、肝脏和肌肉中含量较丰富;在感染刺激隐核虫后,鳃和脾脏EcLAAO-1, EcLAAO-2表达量显著升高(P<0.05),这些结果暗示了石斑鱼LAAO参与先天性免疫,并在抗御刺激隐核虫感染中发挥重要作用。     

斜带石斑鱼MyD88基因的克隆与表达

本研究运用RACE-PCR技术获得斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88,MyD88)基因,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析.研究结果表明1 795 bp的cDNA全长序列,包括ORF 870 bp、5' UTR 243 bp和3' UTR 682 bp,3' UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和两个mRNA不稳定基序(ATTTA).SMART软件预测该蛋白N端和C端分别存在死亡结构域和TIR结构域(Toll/IL-1 receptor homology domain,TIR);与其它脊椎动物MyD88的序列同一性达57.1%～78.7%;用NJ法构建的系统进化树中,斜带石斑鱼MyD88和其它已报导的鱼类MyD88聚为一枝.qPCR检测结果显示MyD88基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和胸腺等组织.本研究为进一步探讨MyD88在斜带石斑鱼TLR信号传导中的作用奠定基础.     

斜带石斑鱼PACAP的原核表达及活性分析

自1989年从绵羊下丘脑提取物发现垂体腺苷酸环化酶激活多肽（Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP）以来（Miyata et al．,1989）,已证明它能促进垂体激素释放,同时还具有神经递质、神经调质和神经营养等作用,使对PACAP的研究成为十分活跃的领域。PACAP属于血管活性肠肽（VIP）-胰高血糖素-生长激素释放因子-分泌素家族（Campbell and Scanes,1992）成员,已鉴别出包含27和38个氨基酸两种类型。对原索动物（McRory et al．,1997）、两栖类（蛙）（Alexandre et al．,2000）、爬行类（蜥蜴）（Pohland Wank,1998）、鸟类（鸡）（McRory et al．,1997）,啮齿类（鼠）（Ghatei et al．,1993）等脊椎动物PACAP的研究多集中在结构与进化方面,对功能了解甚少。     

斜带石斑鱼阿片黑素促皮质素原全长cDNA克隆及序列分析

通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA库和随机测序,克隆了其阿片黑素促皮质素原(Proopiomelanocortin,POMC)全长cDNA。斜带石斑鱼POMC全长cDNA为863bp(含Poly(A)),编码的POMC多肽前体为219aa。氨基酸序列比较分析表明：斜带石斑鱼POMC前体包含有促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropin,ACTH),α—促黑素(α—melanocyte stim—datinghormone,α—MSH),β—促黑素(β—MSH),γ—促脂素(γ-lipotrophic hormone,γ-LPH),β—内啡肽(β-endorphin)等,但缺失了γ—促黑素(γ-MSH)和大部分连接区。斜带石斑鱼POMC与哺乳动物POMC的同源性为39％—42％左右,与鸟类的同源性为42％左右,与两栖类的同源性为36％—41％,与其他鱼类POMC的同源性为38％—77％。斜带石斑鱼和罗非鱼的POMC的ACTH功能区都为40个氨基酸残基,而其他脊椎动物为39个氨基酸残基。     

斜带石斑鱼MyD88基因的原核表达及蛋白纯化

{{@ convertAbstractHtml(article.abstractinfoCn, "cn")}}       

实验感染卵圆鲳鲹的刺激隐核虫GD1虫株皮层的超微结构

自网箱养殖的卵圆鲳鲹（Trachinotus blochii）分离了一株刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）,再经人工感染的方法收集各期虫体,制成电镜样品,对虫体进行超微结构研究。研究表明：刺激隐核虫的毛基体具有典型的9套三联微管系统。幼虫体部单毛基单元有如下特征：单毛基单元结构,具有稍分支的纤毛后微管束（Postciliary microtubular ribbon）,由3根微管组成,起源于第3三联微管,向后延伸至细胞表面。滋养体体部单毛基单元特征是具有分支的纤毛后微管束,由3-6根微管组成,起源于第9三联微管。毛基体的第4-7组三联微管处发出一条长而无分支重叠的动纤丝（KD）,KD向右前方伸延到质膜脊的顶端。在横微管（T）左侧的第3三联微管处有一个横行支持物即横带,由3根微管组成,与来源于第3-4三联微管的横纤维（Tf）相连。刺激隐核虫的体部毛基单元具有一个独特特征：即具有体部线带（N）,是一束平行排列的微管,它们起源于邻接横微管和横纤维的致密板,滋养体的体部线带相互重叠交错排列,以此支撑细胞的横轴。滋养体期还有厚的表质层（Epiplasmic layer）。体部双毛基单元即为邻近口区的双毛基单元,每一排动基列的前几个毛基单元都是双毛基单元,极似口部毛基单元,口部双毛基单元的后面有3-4个体部双毛基单元。幼虫和滋养体的体部双毛基单元均具有2个毛基体,其结构模式相似。体部毛基单元的2个毛基体各长出1根纤毛,毛基体与一个旁体囊（PS）相连,其前面有动纤丝。文中分析了刺激隐核虫在形态上与淡水小瓜虫以及相关种类的毛基单元和皮层结构差异,认为刺激隐核虫的分类更适合归于前口类（Prostomatea）,而不是膜口类（Hymenostomatida）。     

斜带石斑鱼生长激素/催乳素家族基因cDNAs的分子克隆及其进化意义

从斜带石斑鱼垂体提取总。RNA,再取其50ng合成SMART cDNA。从所构建的垂体SMART cDNA质粒文库中筛选到生长激素／催乳素基因家族的2个成员的全长cDNA片段：生长激素(GH)基因全长为938bp,编码204个氨基酸;催乳素基因(PRI．)全长为1429bp,编码212个氨基酸。采用计算机软件Mega 2和CLUSTAL W1．64b对9种鱼的生长激素／催乳素基因家族的3个成员(GH、PRL和生长催乳素SL)的氨基酸序列进行系统分析,构建NJ分支系统树,对于序列中的插入／缺失位点则采用Pairaise Deletion,1000次自展(Bootstrap)分析计算各节点支持率。根据3个基因的氨基酸序列构建的系统树表明,石斑鱼与金头鲷、金鲈和牙鲆聚成一类,虹鳟与大马哈鱼聚成一类,鲫鱼与鲶鱼聚成一类,鳗鲡成另外一类。根据石斑鱼全长cDNA推断的氨基酸序列比较表明,SL相对GH和PRL有较高的保守性。石斑鱼的GH、PRL和SL的氨基酸同源性在24％～31％,但其C-端的氨基酸同源性较高,尤其是C-端的3个Cys是严格保守的。其中SL与GH的同源性(30．8％)高于与PRL的同源性(25．6％),GH和PRL的同源性最低(24．1％)。     

刺激隐核虫感染对褐菖鲉的胁迫及鱼体的免疫应答

为探明刺激隐核虫感染对褐菖鲉生理机能的影响,研究分别用2500、5000、7500和10000幼虫/鱼的刺激隐核虫感染褐菖鲉,并分别检测感染后24h、48h、72h和96h各时间点血清中皮质醇(COR)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)含量;肝脏中丙二醛(MDA)和维生素C(VC)含量,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力;鳃和皮肤中溶菌酶(LZM)活力。结果显示,随着感染浓度的增加,血液中COR和GLU含量均出现不同程度的升高,其中2500、5000和7500幼虫/鱼组COR含量的最高值均出现在感染后第3天;而TP含量总体呈现逐步下降的趋势,尤其当感染浓度达到5000幼虫/鱼后,TP含量的下降程度明显增加;肝脏中MDA含量呈先降后升的变化趋势,其中24h、48h和72h各点MDA含量的最大值均出现在10000幼虫/鱼组,最小值则集中出现于在2500和5000幼虫/鱼组;而VC含量则与MDA含量的趋势相反;SOD和CAT活力均出现不同程度的升高;鳃和皮肤LZM活力总体呈先上升后回落的变化趋势。综上可知,刺激隐核虫感染会对鱼体造成氧化胁迫和脂质过氧化反应,其严重程度与感染的虫细胞浓度相关。低浓度感染组的鱼所受胁迫较轻,在滋养体脱落后仍具有一定的自我修复能力;而高浓度感染组鱼免疫因子的释放受到抑制或出现紊乱,即便在虫体脱落后,其体质也很难恢复。     

斜带石斑鱼MyD88基因的原核表达及蛋白纯化简

正Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是一类重要的模式识别受体,其胞外结构域可识别特定的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),胞内的TIR(Toll-like/IL-1 receptor)结构域则参与启动胞内信号转导,诱导细胞产生活性氧中间体(Reactive oxygen intermediate)、活性氮中间体(Reactive nitrogen intermediate)和促炎症因子,在感染早期发挥重要作用[1]。在哺乳动物中,髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor     

日本鳗鲡TLR21基因的鉴定、免疫应答与启动子分析

为研究TLR21（Toll like receptor 21）在低等脊椎动物中的功能及表达调控机制,我们扩增获得了日本鳗鲡TLR21（AjTLR21）cDNA序列,其编码的蛋白具有TLR家族的共同特征。AjTLR21基因结构与其他鱼类和两栖类TLR21相同,由单个外显子编码。荧光定量结果显示,AjTLR21在血液、鳃、脾脏、中肾等11个组织/器官中转录表达,其中在血液中表达量最高。经Poly I:C诱导后8h,AjTLR21在脾脏和中肾中的表达量显著性上调;诱导后16h,AjTLR21在血液、鳃、肠和脾脏中的表达量显著性上调（P < 0.05）。双荧光素酶报告基因结果显示,在AjTLR21 5'上游调控序列-1179 bp到+117 bp存在Poly I:C调节的正调控元件。经Edwardsiella tarda诱导后16h和72h,AjTLR21分别在血液和中肾组织的表达量显著性上调,表明AjTLR21同时也参与了抗细菌免疫应答,其在机体免疫系统中的功能具有多样性。研究对于理解日本鳗鲡AjTLR21的免疫学功能具有重要的理论意义和应用价值。     

卵形鲳鯵对刺激隐核虫的免疫应答和免疫保护研究

用刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的幼虫对卵形鲳鯵(Trachinotus ovatus)进行腹腔注射和体表感染,然后每隔一周用阻动试验(Immobilization assay)检测免疫鱼的抗血清和皮肤培养液对刺激隐核虫幼虫的阻动效价,在第14周中,分别用亚致死剂量和致死剂量的刺激隐核虫幼虫对免疫鱼攻毒以检测所产生的免疫保护力。实验结果显示:两种免疫方法都能让卵形鲳鯵的血清和皮肤生成阻动刺激隐核虫幼虫的特异性抗体,并能使被免疫鱼获得明显的免疫保护,但是体表感染免疫组的血清和皮肤培养液的阻动效价都要比腹腔注射免疫组高,所获得的免疫保护力也更强。同时还发现,免疫鱼血清和皮肤培养液中的抗体存在明显的差异:两者的最初生成时间、达到峰值的时间、变化规律以及阻动效价等都不一致。因此,我们推测鱼类的系统免疫应答和皮肤黏膜免疫应答有可能是相互独立的,或者是不同步的。鱼类的体液免疫应答,特别是黏膜免疫应答对抵御刺激隐核虫的感染起了重要的作用,采用刺激隐核虫虫体疫苗可能成为预防海水鱼类白点病的一种选择。       

实验感染卵圆鲳鲹的刺激隐核虫DG1虫株胞口的超微结构研究

作者从卵圆鲳鲹Trachinotus blochii分离了一株刺激隐核虫Cryptocaryon irritans,再经人工感染的方法收集各期虫体,制成电镜样品,对虫体的胞口超微结构进行了观察.同时,用银染和免疫荧光染色以及共聚焦显微镜对虫体的胞口周围及内部的纤维和微管进行了观察.结果表明刺激隐核虫的胞口结构与前口类纤毛虫(Prostome)的胞口结构有诸多相似之处,而与归属于膜口类Ophryoglenina小瓜虫差异较大,因此,作者认为刺激隐核虫的分类更适合归属于前口类Prostome,而不是膜口类Ophryoglenina.     

三角帆蚌短型肽聚糖识别蛋白S3基因克隆及表达分析

肽聚糖识别蛋白（PGRPs）是机体先天免疫系统中的重要模式识别受体,研究对三角帆蚌的一种短型肽聚糖识别蛋白进行了克隆与表达分析。研究采用5、3 RACE技术,对高通量转录组测序所得三角帆蚌PGRPS3基因（hcPGRPS3）片段分别进行了5,3末端克隆,经拼接得到hcPGRPS3 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcPGRPS3 cDNA全长序列进行了特征分析,实时荧光定量（qRT-PCR）检测了其组织分布,及经肽聚糖（Peptidoglycan,PGN）和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激后其在肝胰腺中的基因表达变化。hcPGRPS3 cDNA全长1438 bp,开放阅读框为858 bp,编码285个氨基酸,预测分子量大小为32.3 ku,pH 7.0时的理论等点为7.98。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明,其他物种短型PGRP中,以夏威夷短尾鱿PGRP4与hcPGRPS3同源性最高（51%）。qRT-PCR检测结果显示,hcPGRPS3在性腺及肝胰腺中表达水平较高。经PGN或LPS刺激后,肝胰腺中hcPGRPS3表达水平显著上调,表明hcPGRPS3可能在机体抗菌免疫反应中发挥重要作用。     

日本沼虾两种抗脂多糖因子的特性研究

为了研究抗脂多糖因子ALFs在日本沼虾先天性免疫中的功能作用, 研究从日本沼虾中克隆了2种抗脂多糖因子MnALF1、MnALF2。MnALF1 cDNA 全长1008 bp, 编码121个氨基酸; MnALF2 cDNA 全长836 bp, 编码124个氨基酸。这2种氨基酸均包含有一个信号肽序列和一个LPS结合位点, 并且在结合位点的两端(N-端和C-端)都有2个保守的半胱氨酸残基。这2种MnALFs与之前发现的甲壳动物的ALFs是非常相似的。qRT-PCR结果显示MnALFs在所有被检测的组织中均有表达。其中MnALF1主要在心脏和小肠内表达, 而MnALF2则主要在血细胞和肝胰脏中表达。在用嗜水气单胞菌刺激之后发现2种MnALFs在心脏、小肠、血细胞、肝胰脏中都呈现出明显的时间依赖表达模式(MnALF1在刺激之后呈现出先减少后增加的趋势, 之后分别在不同组织的不同时间点达到最大值; 然而, 对于MnALF2, 在心脏和小肠中先减少后增加, 在血细胞和肝胰脏中呈现出先增加后减少, 最后都在24h达到最大值)。结果提示这2种MnALF具有不同的组织特异性, 并且在细菌侵染的免疫防御中起着重要的保护作用。     

稀有鲫热激蛋白70的分子克隆及表达特征分析

为研究稀有鲫（Gobiocypris rarus）HSP70用于淡水毒理学和风险评估方面的可行性,通过cDNA末端快速扩增的方法首次从稀有鲫肝脏中成功克隆出HSP70基因的cDNA全长,命名为GrHSP70。NCBI比对分析结果显示,GrHSP70核苷酸序列与其他鱼类的HSP70基因的核苷酸序列相似性极高,相应的氨基酸序列同源性也高（大于95%）。通过实时定量PCR获得未经污染物暴露的稀有鲫幼鱼体内13种组织中GrHSP70的分布以及PCP暴露后肝脏中该基因的表达图谱,结果表明GrHSP70在稀有鲫体内的表达呈现出组织依赖性,在性腺组织中的表达最高。此外,在不同时间﹑不同浓度的PCP暴露下稀有鲫肝脏中GrHSP70的表达模式呈现出显著的时间-剂量依赖效应。总之,GrHSP70可作为一种非常敏感的生物标志物,适用于中国淡水环境污染的毒理学研究及风险评估。     

赤眼鳟Toll样受体3基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）Toll样受体3（Toll-like receptor 3,ScTLR3）基因是否参与抗病毒免疫反应,实验运用RACE技术,克隆得到ScTLR3基因cDNA全长序列,并进行了生物信息学分析;通过Real-Time qPCR技术,检测了ScTLR3 mRNA在健康赤眼鳟10个组织中的分布以及感染草鱼呼肠孤病毒（GCRV）后肝脏、脾脏、体肾和头肾中的表达特征。结果表明:ScTLR3基因cDNA序列全长4043 bp,包括5-非编码区（UTR）216 bp,开放阅读框（ORF）2715 bp和3-UTR 1112 bp;ScTLR3共编码904个氨基酸残基,推导的蛋白分子量102.67 kD,理论等电点8.76;SMART结构域预测显示,ScTLR3由N端的信号肽（SP）、富亮氨酸结构域（LRRs）、跨膜结构域（TM）和C端的Toll/白介素-1受体结构域（TIR）组成。实时荧光定量结果显示,ScTLR3mRNA在检测的各组织中均有表达,肝脏中的相对表达量极显著高于其他组织（P0.01）;感染GCRV后,肝脏、脾脏、体肾和头肾组织中ScTLR3 mRNA均上调表达,肝脏、脾脏和体肾组织中的相对表达量在24h达到峰值,分别为对照组的5倍、7倍和6倍。研究表明,ScTLR3具有TLRs家族基因的典型结构特征,并能被GCRV诱导表达,推测其在赤眼鳟抗GCRV入侵免疫反应中发挥了重要作用。