肿瘤相关抗原基因HCA520重组蛋白的表达纯化及其肝癌患者血清中相应抗体的分析

HCA5 2 0是用SEREX(serologicalidentificationofrecombinantcDNAexpressingcloning)方法 ,即用肝癌病人血清从肝癌组织cDNA表达文库中筛选得到的肝癌相关性抗原编码基因 .利用RT PCR技术检测了HCA5 2 0mRNA在各种组织中的分布情况 ,构建了GST融合表达载体并且用亲和层析的方法纯化表达的融合蛋白 .最后用Western印迹检测了重组蛋白的免疫反应性 ,用斑点印迹检测了肝癌病人血清中HCA5 2 0的天然抗体的存在情况 .结果表明 ,HCA5 2 0在各种组织中呈丰度差异分布 ,构建好的pGEX 4T 3重组载体经IPTG诱导后高效表达GST HCA5 2 0融合蛋白 ,其分子量约 4 9kD .经GST Agarose亲和层析 ,重组蛋白得到高度纯化 .Western印迹证实 ,纯化蛋白为目的重组蛋白 ,重组蛋白具有与天然蛋白相同或相似的免疫反应性 .斑点印迹分析表明 ,2 0份肝癌病人血清中有 1份HCA5 2 0抗体阳性 ,而 4份正常人均为阴性 .HCA5 2 0的足量提供 ,可用以研究其在致癌中的作用 ,并可以免疫动物制备抗体 .它作为抗原 ,分析其抗体在不同肿瘤病人中的表达情况 ,评估其在临床肿瘤诊断中的作用     

肿瘤相关抗原基因HCA519在昆虫细胞中的表达和纯化

为进行肿瘤细胞免疫应答的研究及制备肿瘤诊断用抗体 ,利用昆虫细胞表达系统表达了肿瘤相关性抗原HCA5 19的重组蛋白 ,并进行了纯化 .所表达的重组蛋白分子量约 10 0kD ,含 75 5个氨基酸残基 ,在HCA5 19cDNA3′端接入FLAG序列 ,则在重组蛋白C端接入 1个 8肽的FLAG尾 .利用其特异性抗体可以有效地纯化重组蛋白 .该FLAGTAG不影响整个重组蛋白的免疫反应性 .纯化的重组蛋白与天然蛋白具有相同或相似的免疫反应性 .它可与识别天然蛋白的血清抗体发生同样的阳性反应 .HCA5 19的足量提供 ,可以免疫动物 ,制备抗体 ;可作为抗原 ,分析其诱导肿瘤病人CTL的特异应答 ,从而评估其作为临床肿瘤疫苗的可能性     

肿瘤相关抗原HCA520真核表达载体的构建及细胞内表达的定位分析

应用PCR技术获得肿瘤相关抗原HCA520编码基因,构建至pGEM-T Easy载体,测序正确后,亚克隆至pEGFP-N1载体,1％的琼脂糖电泳得到两条带,与预期结果相同;鉴定正确的基因一过性转染至CHO细胞,共聚焦显微镜观察HCA520基因编码蛋白主要位于胞浆靠近胞膜处,为HCA520功能的进一步研究打下了基础。     

斑马鱼肌肉高表达基因近端非编码元件分析及功能检测

为鉴定鱼类肌肉组织特异性顺式调控元件,通过分析斑马鱼多个组织的转录组数据,筛选出肌肉高表达基因及低表达基因.通过MEME对肌肉高表达基因和低表达基因非编码区序列特征进行分析,在5个肌肉高表达基因的转录起始位点上游发现了序列保守的DNA区域,包含6个排列顺序一致的DNA基序.将其中一段目标片段插入具有Tol2转座子元件的...     

人甲状腺受体相互作用蛋白15基因全长cDNA的克隆及其特性

通过生物信息学分析及RT PCR技术 ,从人垂体cDNA文库中克隆到甲状腺素受体相互作用蛋白 15(hTRIP15)的全长cDNA ,长度 1963bp ,编码 4 4 3氨基酸 ,同时克隆该基因不同剪接方式所形成的新的异构体 ,长度 1984bp ,编码 4 50氨基酸 .与基因组序列比较显示该基因具有 12个外显子 ,5号外显子 3′端具有 2个剪切的接点 (-ag) .搜寻UniGene数据库作染色体定位于D15S146 D15S117,该基因在生物进化上具有较高的保守性 ,从单细胞藻类到人类均有该基因同源物表达 ,亚细胞定位为核内 .Northern杂交显示 ,该基因具有 3种不同大小的转录本 ,分别约为 2 0、3 5及 4 0kb ,且在人体各组织中均有一定表达 ,其中骨骼肌、心脏及肾脏组织为高表达 .半定量RT PCR显示在一些内分泌组织均有表达 ,以肾上腺较高 .     

PS-2基因的克隆及其在肝癌中的表达

利用荧光差异显示技术比较了正常肝、肝硬化和肝癌组织 m RNA的表达 ,1 4个有差异的条带通过 Northern blot分析表明其中 9个为阳性 .令人感兴趣的是一个～ 5 0 0 bp的 c DNA片段 ,它在正常肝和肝硬化中低表达 ,在肝癌组织中高表达 .通过测序 ,发现该片段与 PS- 2 ( presenilin- 2 )基因有 94 %的同源性 .PS- 2基因的突变与早发性阿尔茨海默氏症有关 ,但在肝癌发生中的作用未明 .也许 PS- 2基因的上调涉及到肝癌发生的分子机理     

辐射诱导转录子RIGb cDNA对HeLa细胞增殖的抑制作用

核酸序列同源性分析和RT -PCR确定辐射诱导转录子RIGb是染色质重构基因CHD6表达的一个剪接转录子.Northern杂交结果表明,0 . 5Gyγ射线诱导RIGbmRNA表达增加,但4Gy大剂量照射对其表达无明显的影响.正常成人组织Northern杂交结果显示,RIGb基因在心脏、肝脏和睾丸中有高表达.细胞生长曲线分析结果表明,转染和稳定表达RIGb的人宫颈癌细胞(HeLa)的增殖生长受到明显抑制,细胞周期分析发现G1/S期阻滞.     

人SDCT2基因的两种不同转录产物选择性转录机理分析

为了克隆人高亲和力钠离子依赖性二羧酸转运蛋白 (highaffinitysodium dependentdicarboxylatetransporter,SDCT2 ,或NaDC3)基因并研究其生理功能 ,用大鼠SDCT2基因序列作为电子杂交探针对人EST数据库进行电子筛选 ,得到了一系列与大鼠SDCT2序列具有高度同源性的人EST序列 ,将它们拼接成 2个基因重叠群 ,设计特异性PCR引物通过RT PCR扩增得到 2条杂交探针用于筛选人肾cDNA文库 .从肾组织中同时克隆出了人SDCT2基因 2种mRNA变异体的全长cDNA(SDCT2α和SDCT2 β) ,两者 5′端前 3435bp序列完全一致 ,但 3′端长度不同 ,SDCT2 β在第 3435bp以后比SDCT2α多出了 5 85bp的序列 .Northern杂交和RT PCR显示 ,SDCT2α在人肾中的表达丰度最高 ,在肝、脾、胎盘、脑及结肠中也有低水平的表达 .而SDCT2 β主要在肾脏中表达 ,在脾也有低水平的表达 .基因组结构分析表明 ,虽然两种mRNAs均由 13个外显子组成 ,但是SDCT2α的第 13外显子含有 1个poly(A)加尾信号AATAAA ,而SDCT2 β的第 13外显子含有 2个poly(A)加尾信号 .这表明在肾脏和脾脏组织中 ,人SDCT2基因可能通过选择性使用位于第 13外显子不同位置的 2个poly(A)信号而转录出 2种不同长度的mRNA变异体 .     

一种新型锌指蛋白基因——人ZNF313的克隆、定位及表达(英文 )

运用正常可育男性和无精症病人睾丸组织的mRNA差异显示和cDNA末端快速扩增 (RACE)等方法 ,从人睾丸组织中分离了一个同时含有指环结构和C2 H2 结构域的新型锌指蛋白基因———人ZNF3 13。运用荧光原位杂交 (FISH)方法 ,将该基因定位到人染色体 2 0q13。该基因含 6个外显子 ,编码 2 2 8个氨基酸。基因组结构分析显示 ,外显子 6含有的 2个加尾信号 ,产生 2种不同的 3′端非翻译区。Northern杂交及多组织RT PCR的结果显示该基因含有 0 .75kb和 2 .4kb两种转录本 ,其中0 .75kb转录本在正常睾丸中高表达 ,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中该基因低表达。结果提示 :人ZNF3 13基因对精子发生和男性可育性可能起重要作用     

大黄鱼肝细胞肿瘤相关抗原-127基因克隆及分子特征分析

在构建大黄鱼肌肉组织cDNA文库的基础上,克隆了肝细胞肿瘤相关抗原-127基因.克隆到的基因全长l439bp,其中5′-UTR 124 bp,3′-UTR 640 bp,编码序列675 bp,编码224个氨基酸.生物信息学分析显示,大黄鱼HCA127基因存在多个功能位点,即N端糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和亮氨酸拉链结构位点.大黄鱼HCA127氨基酸序列具有较高的保守性,与斑马鱼、胡瓜鱼、大西洋鲑等多种鱼类的相似性在80％以上.在检测的9种组织中,肝细胞肿瘤相关抗原-127基因在肝、肾、肠、鳃、眼、脑组织中表达,其中在脑组织中表达最强,肝和鳃组织中次之,肾和眼组织中表达较微弱.     

Molecular characterization of a Siglec8 variant containing cytoplasmic tyrosine-based motifs, and mapping of the Siglec8 gene

Through efforts to investigate the CD33-like subgroup of sialic acid binding immunoglobulin-like lectins (Siglecs), which are believed to be located on chromosome 19q13.4, we have identified the precise genomic region containing the Siglec8 gene. It is located on chromosome 19q13.4, approximately 330 kb downstream of the Siglec9 gene. Further, we have identified a novel Siglec8 variant, named Siglec8-Long (Siglec8-L), which differs in its last two exons from the previously published mRNA sequence of Siglec8 (GenBank Accession No. AF195092). Both Siglec8 and Siglec8-L are comprised of seven exons, of which the first five are identical, followed by marked differences in exon usage and mRNA splicing. The 499 amino acid protein encoded by the Siglec8-L open reading frame has a molecular weight of 54 kDa. Like the other members of the CD33-like subgroup of Siglecs, except for the previously published Siglec8, Siglec8-L also contains the two tyrosine-based motifs that have been found to recruit both SH2 domain-containing tyrosine and inositol phosphatases.     

定位于染色体9p21-22的一个新基因UBAP1的克隆测序及在鼻咽癌中的表达分析

 在染色体 9p2 1 2 2鼻咽癌杂合性丢失 (lossofheterozygosity,LOH)高频区 ,应用EST介导的定位 侯选克隆策略 ,用RT PCR及Northern杂交检测了 2 2个表达序列标记 (expressedsequencetag ,EST)在鼻咽癌细胞株HNE1和原代培养的正常鼻咽上皮细胞中的表达差异 ,并对其中一个在鼻咽癌细胞株HNE1中表达下调的EST检测了在鼻咽癌活检组织中的表达 .用生物信息学方法获得其全长cDNA序列 ,GenBank登录号AF2 2 2 0 4 3.该基因cDNA全长 2 70 1bp ,其开放阅读框 (openreadingframe ,ORF)编码一个含 50 2个氨基酸、分子量为 55kD的碱性蛋白质 ,在蛋白羧基端含有 2个连续的重要UBA功能域 (ubiquitinassociateddomain) ,属于遍在蛋白相关蛋白家族的一个新成员 ,经国际人类基因命名委员会同意 ,将其命名为UBAP1 (ubiquitinassociatedprotein 1 ) .Northern表达分析显示UBAP1在所检测的人组织中广泛表达 ,但在人的心脏、骨骼肌及肝脏中的表达较强 .UBAP1基因在63 2 % ( 1 2 1 9)的鼻咽癌活检组织中表达下调 .UBAP1基因作为一个遍在蛋白相关蛋白家族的新成员 ,结合其在 9p的重要定位信息 ,有必要进一步研究其表达下调参与鼻咽癌发生发展的可能机制 .     

玉米果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因的全长cDNA克隆及表达

以来自“掖单4号”的玉米果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶（F2KP）基因cDNA片段（AF007582）为基础,运用RT-PCR和RACE技术,从“紫玉糯1号”中获得了1个2469bp的玉米F2KP基因cDNA克隆,命名为mF2KP,GenBank登录号为AF334143。该cDNA包含1个2226bp的开放阅读框,编码741个氨基酸。序列分析表明,两个玉米品种的F2KP基因存在一定差异,mF2KP基因的3′端非编码区比AF007582序列短38bp;在mF2KP的1592、1593和1605位置上,分别比AF007582序列多出1个碱基,导致阅读框在一个小范围内发生了移位,North-ern杂交表明,不同玉米组织中mF2KP的表达差异明显。在茎中mF2KP的表达水平比叶片,苞叶以及雄花序中的表达水平低,但比未成熟种子中的表达水平高,在未成熟种子中,仅能检测到很弱的mF2KP基因表达。