重组卡介苗HSP65抑制小鼠移植黑色素瘤的初步药效学研究

观察卡介苗来源的热休克蛋白HSP65对小鼠移植黑色素瘤的抑制作用并初步探讨可能的作用机制。通过基因工程手段获得纯化的重组HSP65蛋白,与弗氏佐剂联合给药C57BL/6J小鼠。分别设计了两组免疫方案,一组于肿瘤细胞接种前免疫3次,另一组于肿瘤细胞接种前免疫7次。结果在免疫3次的情况下,虽然也能激发较高的特异性抗HSP65抗体,但抑瘤效果不明显(抑瘤率14.2%);增加免疫次数到7次后,抑瘤率高达73.2%,效果显著。经肿瘤组织病理切片发现,增加免疫次数导致肿瘤组织中灶性坏死增加,淋巴细胞浸润增加,且肿瘤细胞病理性核分裂相减少,提示了该疫苗作用的可能机制。     

热休克蛋白HSP65嵌合表达系统的构建和表达

设计一条含(GlySer)3连接肽的引物,从BCG经PCR得到HSP65-Linker的基因片段。将该基因定向克隆入原核表达载体pET42b(+),用大肠杆菌BL21(DE3)转化,构建了pET42-LHSP65的嵌合表达载体。DNA测序正确后经IPTG诱导表达,得到可溶性目的蛋白,Western-blot也证实了此重组蛋白可与抗HSP65发生特异性免疫反应。此重组体的构建为进一步探索HSP65的免疫佐剂功效奠定了基础。     

肿瘤血管新生的数值模拟

利用Overture开发肿瘤血管新生模型的计算程序,使用有限差分法模拟肿瘤血管新生过程中,血管内皮细胞在细胞间基质中的增生和迁徙,阐明了血管内皮生长因子和血管新生因子的调节机制.针对三种调节因子的不同组合下的模型进行数值模拟,对比说明三种因子在肿瘤血管新生中的不同作用.模型计算结果与病理学现象实验一致.     

具新生血管抑制及血管阻断双重作用的肿瘤血管靶向药物研究进展

以血管新生抑制剂和血管阻断剂为代表的肿瘤血管靶向药物作为一种新的抗肿瘤疗法,其研究与开发已取得显著进展,尤其是二者联用已在临床实践中获得更好疗效。因而,近年来具有新生血管抑制和血管阻断双重作用的肿瘤血管靶向药物研究备受关注。这种具双重作用的肿瘤血管靶向药物因同时保持了血管新生抑制剂和血管阻断剂的各自作用特点,在临床肿瘤治疗上更具优势,不仅能一药多靶,增强抗肿瘤疗效,同时还可降低用药剂量,减少毒副作用,提高用药耐受性,故临床应用前景广阔。综述新生血管抑制剂和血管阻断剂的作用机制及特点,介绍具代表性的兼有新生血管抑制和血管阻断双重作用的肿瘤血管靶向药物研究进展。     

肿瘤干细胞与血管新生的研究进展

肿瘤生长及转移依赖于新生血管的形成,大量研究认为肿瘤干细胞与血管新生之间存在密切联系,肿瘤干细胞可能转分化为内皮细胞参与新生血管生成,并通过分泌促血管生长因子、基质衍生因子和低氧诱导因子参与对血管新生的调控。     

热休克蛋白27 在肿瘤中的研究进展

热休克蛋白27(HSP27)作为热应激蛋白表达于各种生理或是环境损伤之后,保护细胞生存,其具有多种功能包括:分子伴侣,抗凋亡,参与细胞运动等。近年来发现HSP27在多种肿瘤中过度表达,参与肿瘤的发生发展,分化,耐药以及转移等方面,因而抑制HSP27成为一种新的肿瘤治疗策略。本文就相关研究进展进行综述。     

热休克蛋白27在肿瘤中的研究进展

热休克蛋白27（HSP27）作为热应激蛋白表达于各种生理或是环境损伤之后,保护细胞生存,其具有多种功能包括：分子伴侣,抗凋亡,参与细胞运动等。近年来发现HSP27在多种肿瘤中过度表达,参与肿瘤的发生发展,分化,耐药以及转移等方面,因而抑制HSP27成为一种新的肿瘤治疗策略。本文就相关研究进展进行综述。     

CXC趋化因子与肿瘤血管新生

趋化因子在免疫调节、血管新生以及介导肿瘤的器官特异性转移中发挥重要作用。其中CXC趋化因子超家族由于N-端谷氨酸-亮氨酸-精氨酸基序（Glu—Leu-Arg,ELR motif）的有无使其在血管新生过程中具有了促进或者抑制血管新生的不同作用：含有ELR（ELR^＋）的CXC趋化因子经血管内皮组织上CXCR2介导血管新生促进作用;而不含有ELR（ELR^-）的CXC趋化因子通过血管内皮组织上CXCR3介导血管新生抑制作用。     

姜黄素抑制小鼠脉络膜新生血管的实验研究

目的：观察姜黄素对激光诱导的小鼠脉络膜新生血管（choroidalneovascularization,CNV）形成的影响。方法：60只雄性C57BL／6小鼠,随机分为对照组、10mg／kg姜黄素治疗组、30mg／kg姜黄素治疗组,每组20只。采用激光诱导产生小鼠CNV模型。由光凝前3天开始,至光凝后14天,两个治疗组每天分别给予腹腔注射相应剂量的姜黄素,对照组腹腔注射二甲亚砜溶液（溶剂）。光凝后第3天通过免疫组化和ELISA检测血管内皮生长因子（vesselendothelialgrowthfactor,VEGF）的表达;第14天通过组织学检查以及荧光素标记的葡聚糖的血管灌注检测CNV的面积,荧光血管造影评价CNV的渗漏程度。结果：光凝后第14天,组织学检查显示姜黄素能够有效缩小激光诱导的CNV;荧光素标记的葡聚糖血管灌注后测量色素上皮-脉络膜铺片上CNV的面积,和对照相比,姜黄素能显著减小激光诱导的CNV的面积（P〈0．05）;荧光血管造影显示姜黄素能有效抑制CNV的渗漏（P〈O．05）。和10mg／kg姜黄素治疗组相比,30mg／kg姜黄素治疗组小鼠CNV面积缩小和渗漏程度减弱（P〈0．05）。光凝后第3天,VEGF免疫组化和ELISA结果显示姜黄素显著抑制色素上皮一脉络膜复合体中VEGF（P〈0．01）的表达,高刺量组有更强的抑制作用（P〈0．01）。结论：姜黄素可以有效地抑制小鼠CNV的形成,下调VEGF的表达可能是姜黄素抑制CNV的作用机制之一。因此我们推测姜黄素对并发CNV的AMD患者可能具有治疗作用。     

小鼠胚胎干细胞体外分化形成新生血管的实验研究

目的探讨小鼠胚胎干细胞(ES)在体外向内皮细胞(ECs)分化并形成新生血管的条件及特点。方法分别建立二维和三维小鼠ES细胞分化体系,对分化细胞行血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)免疫荧光染色和DiI-乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)标记,观察ECs分化及血管形成特点。结果在二维分化体系,ES细胞在无外源性生长因子存在的条件下可自发向ECs分化,ECs主要定位在分化细胞密集处,分化表现为:ECs呈集落样生长,不形成网状结构;ECs互相连接形成网状结构,PECAM-1免疫荧光染色证实为ECs网。在三维的悬浮拟胚体培养体系,ECs的分化不依赖于外源性生长因子,分化表现为条索状结构、管腔样结构及排列紊乱的细胞团三种形式。对该拟胚体的冷冻切片进行的三维图像重构显示,拟胚体中有大量的血管网形成。在三维的Ⅰ型胶原培养体系中,ES形成的拟胚体表现为出芽式血管新生,这一过程依赖于外源性生长因子混合物。结论在二维和三维ES细胞分化体系中,ECs分化及新生血管形成过程与体内相似,表现为血管生成和血管新生两种形式,因此可作为研究血管发育机制的理想模型。     

结核杆菌Hsp65与人IL-2融合蛋白在耻垢杆菌表达

目的：构建能够分泌表达结核分枝杆菌热休克蛋白65（Hsp65）与人IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（recombinant Mycobacterium Smegmatis,rMs）。方法：用EcoRV和HindIII双酶切含Hsp65．IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断Hsp65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中。重组质粒pDE22-hsp65-IL-2酶切鉴定正确后,电穿孔转化MS感受态,潮霉素抗性压力筛选阳性rMs。Westem—blot鉴定rMs培养上清蛋白中目的蛋白的表达。结果：重组pDE22-hsp65-IL-2质粒酶切后可获得约2000bp片段,与预期大小一致。Western-blot结果表明,rMs培养上清蛋白中有特异性反应条带,大小为78kD,与Hsp65-IL-2融合蛋白大小相一致。结论：成功构建了大肠埃希菌．分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22-hsp65-IL-2,为该rMs的免疫学特性及抗结核分枝杆菌感染的保护效果研究奠定了基础。     

结核杆菌Hsp65 与人IL-2 融合蛋白在耻垢杆菌表达

目的:构建能够分泌表达结核分枝杆菌热休克蛋白65(Hsp65)与人IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium Smegmatis,rMs)。方法:用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切含Hsp65-IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断Hsp65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中。重组质粒pDE22-hsp65-IL-2酶切鉴定正确后,电穿孔转化MS感受态,潮霉素抗性压力筛选阳性rMs。Western-blot鉴定rMs培养上清蛋白中目的蛋白的表达。结果:重组pDE22-hsp65-IL-2质粒酶切后可获得约2000 bp片段,与预期大小一致。Western-blot结果表明,rMs培养上清蛋白中有特异性反应条带,大小为78kD,与Hsp65-IL-2融合蛋白大小相一致。结论:成功构建了大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22-hsp65-IL-2,为该rMs的免疫学特性及抗结核分枝杆菌感染的保护效果研究奠定了基础。     

热休克蛋白70的主要功能和应用前景

热休克蛋白70(HSP70)是生物体在各种应激条件下产生的蛋白之一,具有维持细胞自身稳定等多种生物学功能.随着研究的深入,在生物学的功能不断被发现的同时,HSP70的应用前景也变得越来越广泛.     

结核杆菌抗原HSP65基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :为研制预防结核病疫苗 ,选取结核杆菌HSP65蛋白为免疫抗原 ,将结核分枝杆菌HSP65抗原基因在大肠杆菌中表达、纯化。方法 :将HSP65的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX5T中 ,构建成pGEX5T HSP65重组质粒。将质粒转化到E .coli.K80 2细菌 ,用IPTG诱导HSP65表达 ,然后用亲和层析的方法进行纯化 ,最后用Western blot方法确认表达蛋白的特异性。结果 :获得了pGEX5T HSP65重组子 ,HSP65蛋白在k80 2菌中获得了表达 ,表达的蛋白条带大小约 86kDa ,与预期的结果相符。表达产物经亲和层析后获得了较单一的蛋白条带 ;表达及纯化的蛋白在纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别。为进一步研究其在结核病诊断和防治中的应用打下了基础。     

Hsp65与IL-2融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答及保护力

目的研究Hsp65与hIL-2的融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法在大肠杆菌中诱导表达Hsp65与hIL-2的融合蛋白,通过Ni-NTA亲合柱纯化后的蛋白经鉴定后,与佐剂DDA和MPL联合免疫小鼠,连续免疫3次,每次间隔2周,最后一次免疫结束后两周,分离5只小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖指数,IFN-γ和IL-2水平,以及特异性淋巴细胞杀伤功能,其余5只免疫小鼠用于MTB毒株攻击实验。结果获得融合蛋白可分别与抗Hsp65和抗hIL-2的单抗发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞被有效活化,诱导产生的-γIFN和IL-2的水平以及CTL杀伤功能均显著高于BCG和单纯Hsp65免疫组（P〈0.05）。融合蛋白免疫组可有效抵抗MTB毒株攻击,脾脏细菌数显著减少（4.36±0.48）,提供的保护力与BCG相当（4.30±0.53）。结论Hsp65与hIL-2的融合蛋白是一种有效的亚单位疫苗,可用于TB的预防。     

P277多肽融合热休克蛋白65提高抗1型糖尿病的作用

为了提高P277肽抗1型糖尿病的作用, 把P277肽融合在卡介苗热休克蛋白65的C端, 构建了pET28a- HSP65-P277高效表达载体, 在大肠杆菌中高效可溶性表达。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析分离纯化了融合蛋白HSP65-P277。使用HSP65-P277在没有任何佐剂存在的情况下免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠, 通过三次腹腔注射, 每月收集被免疫动物的血清, 血糖浓度用自动生化分析仪测定。结果显示HSP65-P277免疫组小鼠血糖平均值及糖尿病的累积发病率和其余组相比均有显著差异(P<0.01), 融合蛋白HSP65-P277抗NOD小鼠糖尿病的作用显著高于单独的P277和HSP65。为进一步开发能用于临床的1型糖尿病疫苗提供了良好的设计思路, HSP65-P277极有可能进一步发展成为新的抗I型糖尿病的疫苗。     

P277多肽融合热休克蛋白65提高抗1型糖尿病的作用

为了提高P277肽抗1型糖尿病的作用, 把P277肽融合在卡介苗热休克蛋白65的C端, 构建了pET28a- HSP65-P277高效表达载体, 在大肠杆菌中高效可溶性表达。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析分离纯化了融合蛋白HSP65-P277。使用HSP65-P277在没有任何佐剂存在的情况下免疫非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠, 通过三次腹腔注射, 每月收集被免疫动物的血清, 血糖浓度用自动生化分析仪测定。结果显示HSP65-P277免疫组小鼠血糖平均值及糖尿病的累积发病率和其余组相比均有显著差异(P<0.01), 融合蛋白HSP65-P277抗NOD小鼠糖尿病的作用显著高于单独的P277和HSP65。为进一步开发能用于临床的1型糖尿病疫苗提供了良好的设计思路, HSP65-P277极有可能进一步发展成为新的抗I型糖尿病的疫苗。     

OPG-HSP65重组蛋白的原核表达及其生物学活性研究

PCR扩增OPG-HSP65基因,构建原核重组表达载体pET-28a－OPG-HSP65,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白。对重组蛋白进行Western blot检测表明,重组蛋白能与抗His-Tag单克隆抗体及鼠抗人OPG单克隆抗体特异性结合。对重组蛋白进行尿素洗涤纯化,进而透析、复性。经破骨细胞生长抑制实验和抑炎实验表明,重组蛋白能减少破骨细胞生成及减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应。     

Identification of Mixed Lineage Leukemia 1(MLL1) Protein as a Coactivator of Heat Shock Factor 1(HSF1) Protein in Response to Heat Shock Protein 90 (HSP90) Inhibition

Heat shock protein 90 (HSP90) inhibition inhibits cancer cell proliferation through depleting client oncoproteins and shutting down multiple oncogenic pathways. Therefore, it is an attractive strategy for targeting human cancers. Several HSP90 inhibitors, including AUY922 and STA9090, show promising effects in clinical trials. However, the efficacy of HSP90 inhibitors may be limited by heat shock factor 1 (HSF1)-mediated feedback mechanisms. Here, we identify, through an siRNA screen, that the histone H3 lysine 4 methyltransferase MLL1 functions as a coactivator of HSF1 in response to HSP90 inhibition. MLL1 is recruited to the promoters of HSF1 target genes and regulates their expression in response to HSP90 inhibition. In addition, a striking combination effect is observed when MLL1 depletion is combined with HSP90 inhibition in various human cancer cell lines and tumor models. Thus, targeting MLL1 may block a HSF1-mediated feedback mechanism induced by HSP90 inhibition and provide a new avenue to enhance HSP90 inhibitor activity in human cancers.