影响紫云英根瘤菌入侵和根瘤发育的exo基因的克隆及分析

紫云英根瘤菌菌株１０７的３个胞外多糖缺陷突变株ＮＡ－０１、０２、０４不具备诱导宿主植物紫云英结瘤的能力。以ＮＡ－０１突变位点的ＤＮＡ面为探针,从可互补这３个变种的ｅｘｏＲ’－１１质粒上亚克隆到２．６ｋｂ的ＤＮＡ片段。互补试验表明,２．６ｋｂ的片段不仅可纠正突变株的胞外多糖缺陷表型,而且使变种恢复诱导宿主植物形成有效根瘤的能力,２．６ｋｂ片段经Ｔｎ５定位突变后丧失这种恢复能力,表明该片段带有对应于３     

紫云英根瘤菌菌株107exo基因簇的遗传互补分析

紫云英根瘤菌菌株１０７经Ｔｎ５插入诱变,得到１２株胞外多糖缺陷型变种,以质粒ｐＭＮ２为载体,从其中７株ＥＰＳ－变种内分别构建了７个Ｒ－Ｐｒｉｍｅ质粒（ｅｘｏＲ＇）,大部分变种的ＥＰＳ－表型可被ｅｘｏＲ＇互补,恢复野生型表型（ＥＰＳ＋）。互补表明,１２株ＥＰＳ－变种可分为６个不同的互补群,其中５个在遗传上连锁。ｅｘｏＲ＇酶切分析,除ｅｘｏＲ＇－０２,ｅｘｏＲ＇－０４外,其余５只的外源片段均整合于ＰＭＮ２的两同向重复序列ＩＳ２１之间。     

紫云英根瘤菌107菌株exo基因簇非连锁突变位点的克隆

用鸟枪法从３株紫云英根瘤菌１０７菌株的胞外多糖合成缺陷变种ＮＡ－０５、ＮＡ－０７和ＮＡ－０８中克隆获得含有１０７菌株ｅｘｏ基因及Ｔｎ５的ｅｘｏ：Ｔｎ５片段。以ｐＲＫ４１５为载体构建１０７菌株ＥｃｏＲＩ酶切后ＤＮＡ片段的部分库,用ｅｘｏ：Ｔｎ５做探针原位杂交得到一个阳性克隆。该克隆的外源片段４．２ｋｂ能恢复３个变种的多糖表型及结瘤固氮能力。酶切分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明,３株变种中Ｔｎ５插入位点     

紫云英根瘤菌菌株107exo基因簇的遗传互补分析

紫云英根瘤菌菌株１０７经Ｔｎ５插入诱变,得到１２株胞外多糖缺陷型变种,以质粒ｐＭＮ２为载体,从其中７株ＥＰＳ＾－变种内分别构建了７个Ｒ－ｐｒｉｍｅ质粒（ｅｘｏＲ）大部分变种的ＥＰＳ＾－表型可被ｅｘｏＰ互补,恢复野生型表型（ＥＰＳ＾＋）。互补表明,１２株ＥＰＳ＾－变种可分为６个不同的互补群,其中５个在遗传上连锁,ｅｘｏＰ酶切分析,除ｅｘｏＲ－０２,ｅｘｏＲ－０４外,其余５只的外源片段均整合于ｐＭＮ２     

紫云英根瘤菌胞外多糖合成基因exo1的序列分析

对互补紫云英根瘤菌Ｅｘｏ－Ｎｄｖ－Ｆｉｘ－变种的２．６ｋｂＤＮＡ片段进行序列测定。分析结果表明,该片段内存在一个完整的阅读框架（ＯＲＦ）ｅｘｏ１。ｅｘｏ１编码３４０个氨基酸,为细胞质蛋白。Ｅｘｏ１蛋白序列与苜蓿根瘤菌的糖基转移酶ＥｘｏＵ有较强的同源性。利用启动子检测质粒,分析ｅｘｏ１基因的表达,发现在ｅｘｏ１基因上有两个启动子活性区段,Ｐｅｘｏ１ａ位于基因前端,Ｐｅｘｏ１ｂ位于基因中间。Ｐｅｘｏ１ａ很可能包含了ｅｘｏ１基因的启动子。     

紫云英根瘤菌的exo与nod基因在宿主结瘤过程中的协同作用

紫云英根瘤菌菌株107经转座子Tn5诱变的胞外多糖合成缺陷型变种(Exo~-),在共生性状方面的改变有四种类型。我们选用了仅在宿主根部形成瘤状突起(Calli)的A类(NA-01,NA-02)、形成无效瘤(Nod~ ,Fix~-)的B类(NA-12)及不结瘤的(Nod~-)D类(NA-14)中的四个突变株分别与消除了共生质粒的Exo~ Nod~-变种(热处理变种及ANU-1116)混合接种紫云英幼苗,观察到与D类变种配合的接种组仍不能结瘤,而与A,B两类变种配合的接种组均诱导宿主产生形态正常的无效根瘤,并且该无效瘤全部被Nod~-变种侵占。说明一个表型仍为Exo~ ,但失去共生质粒的Nod~-变种,可在一个含有该质粒的Exo~-变种的帮助下进入根瘤。这提示共生质粒上的结瘤基因(nod)仅与侵染过程的早期有关,瘤的发育尚需根瘤菌的其他基因,其中包括exo基因的参与。 此外,共生质粒缺失的三个异种根瘤菌突变株分别与紫云英根瘤菌Exo~-变种混合接种时,也都在紫云英根部诱导出无效瘤,并且从瘤中能分离到这三个异种菌。表明在最初的识别作用发生后,植物对共生菌的专一性要求有所降低。     

紫云英根瘤菌胞外多糖合成基因exol的序列分析

对互补紫云英根瘤菌ＥｘｏＮｄｖＦｉｘ变种的２．６ｋｂＤＮＡ片段进行序列测定,分析结果表明,该片段内存在的一个完整的阅读框架（ＯＲＦ）ｅｘｏｌ。ｅｘｏｌ编码了３４０个氨基酸,为细胞质蛋白。Ｅｘｏｌ蛋白序列与苜蓿根瘤菌的糖基转移酶ＥｘｏＵ有较强的同源性,利用启动子检测质粒,分析ｅｘｏｌ基因的表达,发现在ｅｘｏｌ基因上有两个启动子活性区段,Ｐｅｘｏｌａ位于基因前端,Ｐｅｘｏ１ｂ位于基因中间,Ｐｅｘｏｌａ     

紫云英根瘤菌糖基转移酶基因exoA的克隆及序列分析

从可互补紫云奶瘤菌胞外多糖合成缺陷变种ＮＡ０３和ＮＡ１０的ｅｘｏＲ‘－１１上亚克隆获得２．０ｋｂ的ＢｇｌＩ酶切片段,命名为ｐＪＢ－Ｈ７０１,ｐＪＢ－Ｈ７０１不仅可纠正变种ＮＡ０３和ＮＡ１０Ｒ的胞外多糖缺陷表型,而且使两变种诱导宿主植物结瘤固氮能力恢复到野生型水平。     

紫云英根瘤菌107菌株exo基因簇非连锁突变位点的克隆

用鸟枪法从3株紫云英根瘤菌107菌株的胞外多糖合成缺陷变种（Exo-）NA－05、NA－07和NA－08中克隆获得含有107菌株exo基因及Tn5的exo::Tn5片段。以pRK415为载体构建107菌株EcoRI酶切后DNA片段的部分基因库,用exo::Tn5做探针原位杂交得到一个阳性克隆。该克隆的外源片段4．2kb能恢复3个变种的多糖表型及结瘤固氮能力。酶切分析和Southern杂交表明,3株变种中Tn5插入位点相近。     

Pseudonodules formation on barley roots induced by Rhizobium astragali

Abstract Symbiotic association Rhizobium astragali with barley roots was induced by a permanent magnetic field. Initially root hairs were deformed. Later, pseudonodules were formed, showing infected cells with infection threads, and bacteroids each enclosed within a peribacteroid membrane. The overall picture is similar to that of legume root nodules. No acetylene reduction activity could be detected in pseudonodules.     

紫云英根瘤菌107菌株酸性胞外多糖的分离纯化及结构分析

用化学沉淀法和柱层析法,分高纯化了紫云英根瘤菌野生型107菌株、胞外多糖合成缺陷型变种NA02及其回复子NA02（R'－11）产生的酸性胞外多糖（EPS）。结构组成分析表明：菌株107与NA02（R＇－11）产生的EPS糖组分均由葡萄糖、半乳糖、核糖和葡萄糖醛酸构成;而变种NA02产生的EPS只含葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸,与野生型显著不同。3个菌株的EPS均有乙酰基取代,而无其它形式的取代基。EPS的酸性来自葡萄糖醛酸。1H－NMR分析表明,野生型菌株107和回复子NA02（R＇－11）的EPS糖残基通过α和β糖苷键方式连接,而变种NA02EPS的糖链中均为α连接方式。     

紫云英根瘤菌159中两个结构和功能不同的nodD基因

紫云英根瘤菌159含2个拷贝的nodD基因。核苷酸序列测定表明由nodD1和nodD2基因所推定编码的nodD1和nodD2蛋白其氨基酸顺序同源性为69％。功能分析显示,在紫云英根瘤菌中nodD1和nodD2基因均能自主表达。由nodD1推定的nodD1能与紫云英种子浸出液（诱导物）共同激活nod基因的表达,而由nodD2推定的nodD2则无此功能。     

Tn5—Mob转座系统对紫云英根瘤菌SR72的诱变和诱动作用

通过接合作用将携带有转座子 Tn5—Mob 的“自杀”性载体质粒 pSUP5011引入紫云英根瘤菌 SR72,得到卡那霉素抗性(Km~r)菌落的频率为6.99×10~(-6),测得受体菌的 Km~r 自发突变频率<10~(-8)。从对1071个 Km~r 突变体进行的植物砂培结瘤试验中筛选出结瘤不固氮(Nod~ ,Fix~-)突变株17个,不结瘤(Nod~-)突变株4个。另外,还从近3000个 Km~r 突变体中选出腺苷营养缺陷型突变株3个。通过 Tn5探针进行的菌落原位杂交试验证明:这21个共生固氮突变株中均含有 Tn5序列,进一步通过接合作用将协助质粒 RP4—4(Tc~r)引入 Nod~ ,Fix~ 突变株,获得了含有 Tn5—Mob 和 RP4—4的新突变株 SR72ZR(Km~r,Tc~r),但试图通过它们的协同作用将SR72中的大质粒诱动转移到根癌农杆菌 A136的试验未获成功.     

氮源对紫云英根瘤菌nod基因表达的作用

高浓度的硫酸铵阻碍了紫云英根瘤菌诱导紫云英根毛发生典型的根毛变形并明显抑制了紫云英结瘤能力。通过对融合子的β-半乳精苷酶活性的测定进一步表明高浓度的硫酸铵对紫云英的结瘤调节基因nodDZ、共同结瘤基因nodA及nodBC的表达有抑制作用而对结瘤调节基因nodD1的表达无抑制作用。     

木瓜凝乳酶基因的克隆及序列分析

通过设计一对特异性的引物,采用RT－PCR方法从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因,并将其重组到pPIC9K载体中,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆,序列测定并利用BLAST软件进行核酸及氨基酸序列相似性分析,结果表明：通过序列组成及特征结构分析,扩增得到的基因为木瓜凝乳酶基因。     

诱导紫云英根瘤菌nod基因表达的一些植物因子

利用柱层析、薄层层析（TLC）和高压液相色谱（HPLC）从紫云英种子中分离并纯化对紫云英根瘤菌nd基因表达有诱导活性的成分,质谱（MS）鉴定为抽皮素（naringenin）。19种类黄酮或非类黄酮化合物对紫云英根瘤菌结瘤基因表达的诱导活性实验表明,紫云英根瘤菌的结瘤基因可以应答多种诱导咸分,除抽皮素外,还有类黄酮物质毛地黄黄酮（luteolin）、大豆素（daidzein）以及非类黄酮化合物7-羟基香豆素（umbelliferone）和葫芦巴碱（trigonelline）。