长效化Exendin-4的研究进展

Exendin-4是一种新型GLP-1类似物,已被用于2型糖尿病的治疗。由于其优良的药学特性成为糖尿病治疗的亮点,而进一步开发设计长效Exendin-4药物成为近年2型糖尿病药物研究的热点。本文就长效Exendin-4药物的国内外研究进展、作用机制以及药效学性质做一综述。     

产HSA—CP融合蛋白毕赤酵母的发酵条件优化

为提高重组毕赤酵母生产人血清白蛋白-C肽融合蛋白（HSA—CP）的产量和生产强度,在摇瓶条件下考察了甲醇诱导时间和浓度对目的蛋白产量的影响。结果表明,质量浓度10g/L的甲醇诱导72h最适于产物表达。通过对7L发酵罐中各因素的优化,得到最佳条件为：初始甘油质量浓度10g/L,30℃培养,菌体生长期和诱导期的pH及溶氧分别控制在pH5．0、30％溶解O2或pH6．0、15％的溶解O2。10g/L的甲醇诱导72h,最终使干细胞质量浓度达到56．43g/L,目的蛋白产量达368．45mg／L。生产强度为3．920mg/（L·h）,目标蛋白的比生产速率为5．12mg/（L·h）。     

检测HSA—GLP-1融合蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立

目的：为检测血清中HSA-GLP-1融合蛋白整体分子的浓度,建立一种特异、灵敏的定量检测食蟹猴体内HSA-GLP-1融合蛋白浓度的双抗体夹心ELISA的方法。方法：采用双抗体夹心ELISA方法,以GLP-1单克隆抗体为包被抗体、HSA-GLP-1融合蛋白为夹心抗原、anti-HSA-Biotin为检测抗体,用Streptavidin-HRP进行免疫放大,TMB显色。结果：建立了检测HSA-GLP-1融合蛋白的ELISA方法,其线性范围为15.6~1000 ng/mL,最低检测限为15.6 ng/mL,与GLP-1、HSA、IL2-HSA均无交叉反应,板内和板间精密度均小于15%,准确度为±15%,冻融稳定性和稀释稳定性良好。结论：建立的HSA-GLP-1蛋白检测方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于HSA-GLP-1融合蛋白在临床前药代动力学试验的定量检测。     

Exendin-4的固相化学合成及鉴定

Exendin-4是首个获准上市的肠促胰素类似物药物,可模拟人体自身激素GLP-1的功能,不仅改善血糖,还能促进胰岛β细胞新生、增殖,抑制β细胞凋亡,改善β细胞功能,促进胰岛素分泌,增加机体对胰岛素的敏感性。根据Exendin-4的潜在市场价值,以Fmoc固相合成策略为基础,NMP为反应溶剂,以HOBt/DIC为缩合剂,添加盖帽程序,优化合成工艺条件。肽树脂裂解采用TFA/Phenol/TIS裂解液,并应用高效液相色谱和四级杆-飞行时间串联质谱对其进行分析鉴定和纯化,最终获得Exendin-4,产率为21%,纯度为99.4%。活性测定结果显示,合成的Exendin-4显著提高胰岛瘤细胞的活性,并呈一定剂量依赖性。     

Exendin-4类似物的克隆、表达与体内生物活性检测

为研究Exendin-4类似物的克隆,融合表达及在体内的生物活性,在pED载体融合伴侣序列中插入利于下游分离纯化的序列成为5#载体,将Exendin-4类似物基因与5#载体中的融合伴侣基因通过酸水解位点连接,转化至E.coli BL21中并诱导表达融合蛋白,酸水解将目的肽与融合伴侣分开后,经阴离子交换树脂分离得到目的肽。6周～8周正常雄性ICR小鼠皮下注射Exendin-4类似物后,口服糖耐量实验检测在不同时间段小鼠血液中葡萄糖及胰岛素含量的变化。结果表明:融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,Exendin-4类似物纯度达91.8%。Exendin-4类似物的活性与对照组相比,具有显著的降低血糖和显著促进胰岛素分泌的活性(P<0.01)。     

ADSCs联合Exendin-4治疗糖尿病大鼠创面愈合的机制研究

摘要 目的：探究ADSCs联合Exendin-4治疗糖尿病大鼠创面愈合的效果及可能机制。方法：通过高脂饲料喂养和腹腔注射链脲佐菌素（STZ,45 mg/kg）建立糖尿病SD大鼠模型。使用直径1 cm的皮肤打孔活检器在大鼠背部制作创面。将72只建模成功的大鼠随机分为糖尿病组、ADSCs组、Exendin-4组和ADSCs+Exendin-4组,每组18只。未建模的20只大鼠作为对照组。皮肤创伤后1天,按照指定给药方案进行给药,每天给药1次,共14天。检测治疗后大鼠的血糖、创面愈合率、微血管密度、创面组织学改变和血管生成因子（VEGF-A、VEGFR-2、PDGF-BB、PDGFR-β和HIF-1α）的蛋白表达水平。另外,将HUVEC细胞分为对照组、高糖组、ADSCs组、Exendin-4组和ADSCs+Exendin-4组,并对各组细胞进行相应的处理。检测了ADSCs和Exendin-4对缺氧和高糖培养的HUVEC的增殖、迁移和血管生成的影响。结果：ADSCs和/或Exendin-4治疗组大鼠的血糖水平与糖尿病组无显著差异（P>0.05）。与单独治疗组相比,ADSCs+Exendin-4组的创面愈合率、微血管密度和创面组织中VEGF-A、VEGFR-2、PDGF-BB、PDGFR-β和HIF-1α的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与单独治疗组的HUVEC相比,ADSCs+Exendin-4组的HUVEC的增殖、迁移和血管生成能力显著提高,并且血管生成因子的表达水平明显上调（P<0.05）。结论：对糖尿病大鼠创面组织局部施用ADSCs和Exendin-4可明显促进创面愈合。ADSCs和Exendin-4通过促进内皮细胞的增殖、迁移及血管生成因子的分泌来促进血管生成和创面愈合。     

LRRC4融合蛋白的构建与表达研究

在前期工作中,采用EST介导的定位候选克隆策略,克隆了一个在脑瘤中表达下调的脑特异表达新基因LRRC4,为进一步研究其结构与功能的关系,构建了含LRRC4基因全长编码区的pGEM-T Easy质粒,在此基础上通过亚克隆构建了LRRC4融合蛋白的绿色荧光蛋白（pEGFP-C1）表达质粒,瞬时转染哺乳动物细胞,结果发现表达的LRRC4融合蛋白定位于活细胞的细胞膜上.同时,构建了LRRC4全长和截短型原核表达pGEX-4T-2质粒,成功而高效地在大肠杆菌BL21 中表达LRRC4融合蛋白.上述工作为制备多抗,深入研究LRRC4基因的功能奠定了基础.     

CTLA4Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达

CTLA4Ig是人CTLA4胞外区与人免疫球蛋白铰链区、CH2区、CH3区组成的融合蛋白,可以与B7结合,通过阻断B7与CD28的结合,从而阻断B7介导的T细胞活化必需的共刺激信号,可作为免疫抑制剂用于器官移植。将CTLA4Ig融合分子克隆到真核表达载体pCI-dhfr,并用脂质体方法转染到COS7和CHO-dhfr-细胞中,用氨甲喋呤筛选转染的CHO-dhfr-细胞。用RT-PCR、ELISA、细胞免疫荧光染色和Western-blot鉴定重组蛋白的表达。采用A蛋白纯化重组蛋白。     

Exendin-4对甲基乙二醛诱导PC12细胞氧化应激的影响

目的：探讨肠促胰岛素类似物（Ex-4）对甲基乙二醛（MG）诱导PC12细胞氧化应激的影响及其机制。方法：传代培养PC12细胞,不同浓度MG（0、0.25、0.50、0.75、1.0、2.0 mmol/l）处理PC12细胞12~48 h,或用不同浓度Ex-4（25、50、100、200 nmol/L）预处理24 h后加用MG（0.75 mmol/L）干预24 h后,MTT比色法检测细胞存活率;荧光探针法检测活性氧（ROS）含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（SOD）活力。Ex-4（100nmol/L）预处理PC12细胞24h加用MG（0.75 mmol/L）干预1 h后,Western blot检测蛋白P-IκB-α、IκB-α表达情况。结果：随着MG浓度的增加和作用时间的延长,PC12细胞存活率逐渐降低;加用不同浓度Ex-4预处理后,PC12细胞存活率较单独MG处理组逐渐升高。100 nmol/L的Ex-4预处理PC12细胞后,ROS表达量较MG单独处理组下降65.30%（P<0.01）; NAC预处理组（阳性对照）ROS表达量下降107.40%（P<0.01）;Ex-4预处理组SOD活力增加5.30 U/mg prot（P<0.01）;NAC预处理组SOD活力增加8.53 U/mg prot（P<0.01）。Ex-4预处理组P-IκB-α/IκB-α表达比例下降25.50%（P<0.01）; NAC预处理组P-IκB-α/IκB-α表达比例下降35.14%（P<0.01）。结论：Ex-4浓度依赖性地增加MG诱导的PC12细胞的存活率。Ex-4能够减轻MG诱导的PC12细胞的氧化应激,其机制可能涉及抑制蛋白IκB-α的活化。     

Exendin-4通过JNK和ERK信号通路增强大鼠脂肪来源干细胞的增殖

目的:探讨Exendin-4对大鼠脂肪来源干细胞的(Adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖作用及其机制。方法:体外分离培养SD大鼠腹股沟处脂肪组织,流式细胞学方法鉴定分离的ADSCs,使用Exendin-4(Ex-4,0-50 nm/L)对P4代(第四代)ADSCs进行干预,采用MTT检测ADSCs的增殖情况,Western blot检测MAPK通路中JNK和ERK的磷酸化水平,使用相应的阻断剂来观测JNK和ERK通路对ADSCs增殖作用的影响。结果:分离培养的ADSCs高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD31、CD34和CD45,符合间充质干细胞的表型。Ex-4以浓度依赖方式促进ADSCs体外增殖,10 nm/L为最适促增殖处理浓度。同时,Ex-4可以提高细胞中c-Jun和ERK的磷酸化水平,而给予相应阻断剂后,磷酸化蛋白表达减弱,细胞增殖能力也明显减弱。结论:Ex-4可以通过JNK和ERK通路增强大鼠脂肪来源干细胞的增殖。     

GST-Exendin-4在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

为了制备GST-Exendin-4融合蛋白,以本实验室构建好的pET22b-Exendin-4为模板,通过PCR扩增出Exendin-4基因,酶切克隆入pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Exendin-4.经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同浓度的IPTG和不同温度诱导下,经SDS-PAGE分析鉴定,表达出Mr约为30 kD的目的蛋白,灰度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的29.9%,超声裂解后的上清通过Sepharose 4B亲和层析纯化、透析、除盐及冷冻干燥得到高纯度的目的蛋白.本研究成功制备了高纯度的GST-Exendin-4融合蛋白,为下一步进行目的蛋白大规模的生产打下了良好的基础.     

SDH-SV2C-L4融合蛋白的表达及山梨糖脱氢酶活性检测

目的:构建SDH-SV2C-L4融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达具有山梨糖脱氢酶(SDH)活性的融合蛋白。方法:将C亚型突触囊泡蛋白2大突环L4(SV2C-L4)基因与SDH基因以GGGS柔性接头连接,在大肠杆菌DH5α中表达;用NBT染色和DCIP脱色的方法检测融合蛋白的SDH活性。结果:DNA测序及SDS-PAGE结果显示构建了融合蛋白表达载体,并表达了SDH-SV2C-L4融合蛋白,相对分子质量约80×103;DCIP脱色及NBT染色均检测到融合蛋白的SDH活性。结论:与SV2C-L4融合的SDH仍具有活性,为下一步SV2C-L4活性检测方法的建立及SDH与SV2C-L4的其他相关研究奠定了基础。     

Exendin -4在大肠杆菌中的串联表达、纯化及活性鉴定

目的:完成钝尾毒蜥Exendin -4基因在大肠杆菌中的串联高效表达.方法:按照大肠杆菌偏爱密码子设计Exendin -4基因片段,利用同尾酶构建多拷贝串联的表达载体,于大肠杆菌BL21( DE3)中诱导表达,SDS - PAGE鉴定结果,表达产物Ni柱纯化后肠激酶切割,高效液相色谱及四级杆-飞行时间质谱纯化、鉴定,确定目标产物,作用胰岛瘤细胞INS -1检测胰岛素释放活性.结果:成功构建重组载体pET28a -(Exendin -4)n(n=2,4,6),且均获得可溶性表达产物,重组表达蛋白经切割、纯化、鉴定和制备,最终得到纯度98%的Exendin -4,其具有与标准品相似的促葡萄糖刺激的胰岛素释放活性.结论:试验成功利用串联表达方式制备有活性的Exendin -4,为下一步2型糖尿病治疗药物的研究奠定了基础.     

HIV-1融合蛋白MA4-CA在大肠杆菌中的高效表达

将HIV-1MA4-CA融合基因克隆到高效表达载体pBV220中,将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS—PAGE检测。结果表明,成功地构建了含MA4-CA融合基因的表达载体pBV220-MA4-CA,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为16000并以包涵体形式存在的融合蛋白,此蛋白经洗涤后能够溶于8mol／L的尿素中。利用硫酸铵沉淀法进行初步纯化后即可得到纯度比较高的MA4-CA融合蛋白,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。     

重组GM—CSF／IL—3融合蛋白的纯化

重组粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素３（ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３）融合蛋白是一种很有发展潜力与应用前景的重组药物,它在大肠杆菌中是以饱含体形式表达的,针对这一重组蛋白饱含体的洗涤、变性、复性以及最终的纯化过程,进行了深入地研究,重点分析和比较了不同条件及因素对于重组蛋白包含体变性及复性过程听影响。实验结果表明,８ｍｏｌ／Ｌ尿素及１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＤＴＴ可以使包含体充分溶解。在复性过程中,采用     

Vsig4 和免疫球蛋白Fc段融合蛋白的真核表达纯化

目的:本项目将通过构建中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取小鼠Vsig4膜外端和免疫球蛋白Ig G3a-Fc段的融合蛋白,鉴定Vsig4-Fc和Vsig4纳米抗体的相互作用。方法:采用重合延伸PCR法融合小鼠Ig G3a-Fc和Vsig4胞外段的基因序列,将该融合基因插入真核表达载体中并转染CHO细胞。Western blotting鉴定转染细胞上清中的目标蛋白,通过连续两次亚克隆筛选,获得高表达小鼠Vsig4-Fc融合蛋白的单克隆,之后大量培养增殖转染细胞并收集细胞培养上清,选择Protein A柱纯化方法纯化Vsig4-Fc蛋白,最后经ELISA法鉴定Vsig4-Fc和纳米抗体的结合能力。结果:在CHO细胞中成功构建了小鼠Vsig4-Fc真核表达稳转系,并且在真核表达体系中获得可表达15 mg/L的双分子结构Vsig4-Fc的稳定转染细胞系。经鉴定小鼠Vsig4-Fc融合蛋白能与Vsig4纳米抗体结合。结论:重合延伸PCR法使得Vsig4和Fc基因片段的融合更为高效,两次亚克隆筛选优势细胞系大幅提高了真核蛋白的表达量,为进一步研究Vsig4的生物学功能奠定重要基础。     

GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白的表达与鉴定

将合成的人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)突变体基因与IgG4抗体的Fc部分进行融合获得GLP-1-IgG4-Fc片段,获得的基因片段与pXC17.4载体进行连接,用电转化方法将线性化质粒稳定转染CHO-K1细胞,通过Clone Pix 2筛选出高表达细胞株,产量达1.5g/L。收集培养上清并经Protein A和Source 30Q纯化,得到的GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白,SDS-PAGE纯度高于95%,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度和毛细管区域凝胶电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)纯度均不低于80%,尺寸排阻层析(size-exclusion chromatography,SEC)纯度高于99%。经质谱和肽图谱测定,分子量与理论值一致,肽图谱序列与对照品高度一致。生物学活性分析表明,GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞分泌环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的活性,并且该活性与对照品高度相似。     

病毒融合蛋白的结构和功能

病毒融合蛋白可以分为三种类型,不同类型的病毒融合蛋白的结构差异很大,但是会采用相似的"发卡"构象实现融合.在一定条件下,病毒融合蛋白的疏水结构域,融合环或融合肽插入靶膜中,通过其自身折叠形成发卡使病毒和宿主的膜靠近.与此同时,融合蛋白构象变化会释放出足够的能量将双方膜打破并完成融合.本文中,我们总结了三种类型病毒融合蛋白的特征,并对其中央发卡三聚体结构域、跨膜结构域以及近膜结构域在融合过程中的作用进行了论述.     

铜绿假单胞菌OprF/I融合蛋白疫苗研制现状

铜绿假单胞菌是一种革兰阴性非发酵和需氧的机会性致病菌,是医院获得性感染的常见病原体。铜绿假单胞菌治疗面临巨大挑战,研制疫苗是防治铜绿假单胞菌感染的有效替代方法。融合外膜蛋白OprF/I是一种保护性抗疫苗以及重组沙门菌疫苗的研制现状进行综述。